Análisis funcional de la proteína de fusión Gc del virus Andes y sus ensamblaje en partículas virales recombinantes
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Fecha
2011
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
La fusión entre la membrana viral y la membrana celular es un paso crucial en la entrada de los virus envueltos a la célula. Datos previos de nuestro laboratorio permitieron proveer evidencia que la actividad de fusión de los hantavirus está asociada a la glicoproteína Ge, la que junto con Gn se encuentra inserta en la membrana del virión. En dicho trabajo se predijo, mediante análisis de secuencias in si/ico y estudios con péptidos in vitro, una secuencia que incluye un putativo péptido de fusión. En proteínas de fusión virales, esta región funcional establece el primer contacto con la membrana celular blanco para iniciar el proceso de fusión. En el presente trabajo de tesis, se propuso como hipótesis que Ge del virus Andes (ANDV) posee residuos aminoacídicos esenciales para su actividad fusogénica, localizados entre los residuos W115 y G128 del péptido de fusión candidato.
Para responder la hipótesis planteada, se generaron mutaciones sitio dirigidas en el péptido de fusión candidato y se midió la actividad fusogénica de las proteínas mutantes mediante un novedoso ensayo funcional de fusión entre células, que utiliza tres fluoróforos para la visualización de sincicios. Además, se desarrolló un sistema de producción de partículas lentivirales pseudotipificadas con Gn/Gc de ANDV, que permitió incorporar por primera vez mutantes de Ge. Se encontró que las sustituciones de los residuos en las posiciones W115 y N118, pero no G116, afectaron tanto la formación de sincicios como la infectividad de sus correspondientes partículas pseudotipificadas en el paso de fusión de membranas. De esta manera, se corroboró que la región comprendida entre los aminoácidos 115-121 de la proteína de fusión Ge de ANDV incluye residuos esenciales para su actividad fusogénica y además reafirmó que esta región podría corresponder al péptido de fusión de ANDV.
Las herramientas desarrolladas durante la caracterización del péptido de fusión de Ge de ANDV fueron usadas en paralelo con el objetivo de caracterizar otros aspectos de la entrada de hantavirus a la célula. Se logró determinar: i) que la entrada de los hantavirus a la célula depende de la presencia de colesterol en la membrana celular y ii) que el pH de activación de Ge es pH :::; 5,8. Estos datos sugieren que los hantavirus podrían usar balsas lipídicas durante su entrada a la célula y que la liberación de las ribonucleocápsides al citoplasma celular podría ocurrir desde compartimentos endosomales tardíos.
Durante el presente trabajo además se desarrolló una metodología que permite incorporar las glicoproteínas de ANDV en partículas semejantes a hantavirus. Se demostró por primera vez, que el ensamblaje de partículas semejantes a hantavirus solo requiere las glicoproteínas virales. Estas partículas, además de representar la unidad mínima de ensamblaje descrita para los hantavirus, poseen un gran potencial para generar nuevas estrategias preventivas, terapéuticas y diagnósticas de las enfermedades causadas por este patógeno humano.
Notas
Tesis (Doctor en Biotecnología)
Palabras clave
Hantavirus, Proteínas