Redistribución nuclear de ARN polimerasa II iniciadora y TCF7L2 por efecto de la vía de señalización WNT/ß-catenina en células KG-1

Abstract

La hematopoyesis es el proceso de formación, desarrollo y maduración de células sanguíneas y es regulada por distintas vías de señalización, entre ellas: la vía de señalización Wnt/β-catenina. Sin embargo, cuando se producen mutaciones en genes que regulan este proceso se pueden generar distintos tipos de cáncer, como la Leucemia Mieloide Aguda (AML). Las translocaciones cromosómicas son una característica distintiva de las leucemias y recientemente se ha sugerido que las translocaciones cromosomales son producidas en focos de transcripción activa por efectos de inestabilidad genómica causados por una sobreactivación de la transcripción o deficiencias en la maquinaria encargada de la reparación del ADN. β-catenina es capaz de producir inestabilidad genómica, por lo que la activación de la vía Wnt/β-catenina podría estar asociada a la reorganización de la maquinaria transcripcional en el núcleo. En esta tesis, se evaluó el efecto de la vía de señalización Wnt/β-catenina en la localización, redistribución e interacción del complejo β-catenina/TCF7L2 y focos activos de transcripción caracterizados por la RNA Polimerasa II. A través del estudio del patrón de expresión de las proteínas ARN Polimerasa II Iniciadora, ARN Polimerasa II Elongadora, TCF7L2 y β-catenina por inmunofluorescencia en células KG-1, un modelo de AML, se determinó la localización y redistribución en el núcleo de estas proteínas luego de la activación de la vía Wnt/β-catenina con medio condicionado Wnt3a o el activador farmacológico CHIR98014 por 4h, a través de la medición del conteo y diámetro de estos focos. Nuestros resultados indican que la ARN Polimerasa II Iniciadora y TCF7L2 tienden a focalizarse, disminuye el diámetro y número del complejo al activar la vía Wnt/β-catenina. Sin embargo, la interacción entre ambas aumenta, dando cuenta de una agregación de los componentes de la transcripción en estas células, en respuesta a la activación de la vía de señalización. Teniendo en cuenta la interacción y agregación de estos focos de transcripción en respuesta a una vía de señalización a tiempos tempranos, nos permitiría dilucidar que estos agregados de la maquinaria de transcripción asociados a una alta frecuencia de generación de transcrito, produzcan una saturación de sus componentes generando errores que gatillen en aberraciones cromosómicas como lo son las translocaciones. Esta investigación nos profundizar este problema y buscar generación de mecanismos que eviten la producción de aberraciones cromosomales, a través de compuestos que inhiban, bloqueen, o atenúen estas interacciones que producen fenómenos que alteran el normal funcionamiento de un proceso biológico como lo es la hematopoyesis.

The hematopoiesis is the process of formation, development and maturation of blood cells and is regulated by many signaling pathways, among them: the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, when mutations are produced in key regulator genes these are capable of generating many kind of cancers, like Acute Myeloid Leukemia (AML). Chromosomal translocation is a distinctive feature of leukemia and it has been recently suggested that chromosomal translocation is produced in foci of active transcription as a consequence of genomic instability caused either by transcription overactivation or deficient DNA repair machinery. β-catenin is capable to produce genomic instability, thus the activation of the Wnt/ β-catenin signaling pathway could be associated to reorganization of transcriptional machinery in the nucleus. On this thesis, we studied the Wnt/β-catenin signaling pathway on the interaction and redistribution of the β-catenin/TCF7L2 complexes and active foci of transcription, characterized by RNA polymerase II. Through the study of the expression pattern of the proteins: Initiator RNA polymerase II, Elongation form of RNA polymerase II, TCF7L2 and β-catenin by immunofluorescence on KG-1 cells, an AML model, we determined the localization and redistribution in the nucleus of these proteins after induction of the Wnt/β-catenin signaling pathway with Wnt3a conditioned media or the pharmacological activator CHIR98014 for 4h. We measured the number and diameter of these foci. Our results show that the Initiator form of RNA polymerase II and TCF7L2 tend to focus, decrease the diameter and number of theses complexes. However, the interaction between both proteins increased, realizing of the aggregation of this components of the transcription on this cells, in response to that signaling activation. Given the interaction and aggregation of this foci of protein on transcription factories like an answer to a signaling pathway activation at early induction of transcription, will help us elucidate the role of transcription machinery aggregates associated to a high frequency of transcript generation, produced a saturated transcription machinery, generating mistakes leading chromosomic aberrations like translocations. Result from this investigation allow us to understand the mechanisms to avoid and solved this chromosomic aberrations, through compounds to inhibit, blocked or attenuate this interactions that produce this phenomena altering the normal function of a biological process like hematopoiesis.