Re-ingeniería de la B-glucuronidasa de E. coli para aumentar su eficiencia catalitica por codeína-6-glucurónido
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Fecha
2017
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Idioma
es
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Resumen
El objetivo del proyecto es mejorar la eficiencia catalítica que posee la enzima Pglucuronidasa
de Escherichia coli por codefna-6-glucurónido, a fin de reducir el tiempo de
hidrólisis de éste metabolito en test de doping (actualmente se logra niveles de hidrólisis deseable
en 12 horas). Asumiendo que la eficiencia catalítica de la enzima se correlaciona con la energía
de unión del ligando en una confonnación catalftica, lo que se busca en esta tesis es generar
mutantes que mejoren la afinidad por codeína-6-glucurónido en una confonnación catalltica
similar al primer estado de transición del mecanismo catalftico. A modo comparativo, se partió el
análisis utilizando también morfina-3-glucurónido, para la cual se conoce que la enzima tiene una
eficiencia cataHtica mayor que por codefna-6-glucurónido.
En el Protein Data Bank (PDB) se encuentran 6 cristales de la enzima con diversos rangos
de resolución y largos de secuencia. Para identificar el confónnero que mejor sirva de templado
para nuestros estudios de unión de ligandos en confonnaciones catalíticas, se tomó cada una de
las cadenas presentes en los 6 cristales del PDB y se realizó ensayos de acoplamiento molecular
( docking) de cada uno de las cadenas con ligandos conocidos ( codefna-6-glucurónido y morfina-
3-glucurónido) usando el programa Autodock Vina. El procedimiento anterior arrojó la cadena A
de la estructura 3LPF como el mejor confónnero a partir del cual se llevó a cabo un proceso in
silico de generación de mutaciones simples y múltiples usando Modeller de fonna automatizada.
Para seleccionar los residuos del sitio activo que serían mutados se utilizó el mejor modelo de
docking de 3LPF cadena A y morfina-3-glucurónido o codefna-6-glucurónido, y se identificó los
residuos aminoacfdicos que estaban en proximidad de los ligandos usando VMD. Con la
selección de las mejores mutantes simples, se generaron luego mutantes dobles y triples con
criterios específicos de selección.
Finalmente, evaluamos si las posiciones mutadas que resultan en mejoras en la unión de
codefna-6-glucurónido en confonnaciones catalfticas ocurren en sitios con adaptación positiva
(aquellos donde las mutaciones no sinónimas priman por sobre las mutaciones sinónimas) o sitios
con adaptación negativa (mutaciones sinónimas predominan por sobre las no sinónimas). Existe
evidencia en la literatura para otras familias de enzimas que los sitios con adaptación positiva
están involucrados en cambios de especificidad de sustrato, por tanto, mutaciones racionales en sitios con adaptación positiva reflejarían de mejor manera la evolución natural que seguiría esta
enzima en un organismo confrontado en la naturaleza con el sustrato de nuestro interés. Para
cumplir este objetivo, se identificaron miembros caracterizados de la familia Glicosil Hidrolasa 2
a la que pertenece la P-glucuronidasa de Escherichia coli. A partir de estos se generó una red de
similitud de secuencias con el fin de identificar otros miembros de la familia a partir de bases de
datos públicas de secuencias. En la red, se identificó un grupo qu{parece ser isofuncional para la
actividad P-glucuronidasa que consiste de 3041 secuencias. A partir de estas secuencias se hizo
un alineamiento múltiple y considerando todas aquellas secuencias que conservan los residuos
catalíticos se detenninó la tasa de mutaciones sinónimas y no sinónimas por codón.
La hipótesis de este trabajo postuló que mutantes en sitios con adaptación positiva de la Pglucuronidasa
de Escherichia coli mejoran su eficiencia catalítica por codefna-6-glucurónido.
Lamentablemente, ninguno de los residuos aminoacfdicos mutados presentó selección positiva.
Algunas de las mutantes generadas que fueron caracterizadas por colaboradores en el mesón, a
fin de corroborar si cumplen con su objetivo de mejorar la eficiencia catalftica de Ja enzima Pglucuronidasa
de E. coli con respecto al ligando codefna-6-glucurónido no observaron aumento
de eficiencia con respecto al ligando de interés, lo cual se relaciona con los resultados obtenidos
de adaptación negativa obtenidos en el objetivo 3 de la presente tesis.
Notas
Tesis (Magíster en Biotecnología)
Palabras clave
Escherichia Coli, Enzimas