Silenciamiento a larga distancia mediante microRNAs artificiales
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Fecha
2016
Autores
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Facultad/escuela
Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
Los micro RNAs (miRNAs) son moléculas de 21 ó 22 nucleótidos (nt) que dirigen
el silenciamiento de un gen blanco produciendo un corte de su RNA mensajero o
inhibiendo la expresión de éste. En plantas, cumplen un importante rol en diversos
procesos del desarrollo, metabolismo y respuesta a estrés. Diversos estudios
evidencian que el movimiento de ciertos miRNAs entre tejidos vegetales distantes
ocurre, aunque también se ha descrito que algunos no poseen esta capacidad móvil.
Con estas características, el silenciamiento génico mediante RNAs pequeños,
incluyendo miRNAs, representa una herramienta biotecnológica relevante en áreas
vinculadas al mejoramiento genético vegetal.
En nuestro laboratorio se ha diseñado una estrategia sencilla de ensamblado de
pre-miRNA artificial (amiRNA) utilizando un pre-miRNA endógeno de Vitis vinifera; este
diseño ha permitido la expresión de un amiRNA funcional. Con la hipótesis de que este
amiRNA es capaz de producir señales móviles, en la presente tesis se desarrollaron
líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana expresando constitutivamente el gen que
codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) y el amiRNA para silenciar dicho gen
(amiRNA-GFP). Ambas líneas fueron utilizadas en experimentos de injertación
recíproca.
Resultados preliminares a las injertaciones, utilizando líneas doble transfomantes
de N. benthamiana (miR+/GFP+), permitieron verificar un efectivo knockdown del gen
blanco, lo que fue corroborado mediante análisis fenotípico vía microscopía, mostrando
un descenso en la fluorescencia de las plantas re-transformadas. A nivel molecular
preliminar, evaluaciones RT-PCR mostraron la expresión disminuida del gen GFP.
Adicionalmente, un PCR de horquilla y la secuenciación masiva de RNAs pequeños de
las líneas doble transgénicas generadas, permitieron detectar el miRNA artificial
esperado, además de otras especies asociadas a éste, con tamaños entre 21 a 24-nt.
Para evaluar la capacidad móvil del amiRNA-GFP, se injertaron las líneas GFP+ y
miR+/GFP+, ya sea como portainjerto (pie) o como injerto (aéreo). Los resultados
fenotípicos de estas plantas fueron analizados por microscopía de epifluorescencia y
mostraron que existió una disminución de la fluorescencia verde de las plantas
injertadas con plantas que expresaban el amiRNA-GFP, tanto al utilizar éstas como pie
o como segmento aéreo; esto no fue observado en plantas GFP+ injertadas con los
correspondierntes controles de plantas de Nicotiana no transgénicas (WT). Los
resultados obtenidos indicarían que el silenciamiento de la expresión de GFP estaría
mediado por un movimiento bidireccional del amiRNA-GFP diseñado, reforzando la
eventual utilidad de esta herramienta en diversos estudios tanto básicos como
aplicados.
Notas
Tesis (Magíster en Biotecnología)
Este trabajo de tesis fue financiado por el proyecto “BIOFRUTALES- MEJORAMIENTO GENÉTICO DE VIDES” PBCT. Código: 501775-46
Este trabajo de tesis fue financiado por el proyecto “BIOFRUTALES- MEJORAMIENTO GENÉTICO DE VIDES” PBCT. Código: 501775-46
Palabras clave
Micro RNA, Mejoramiento de Plantas, Biotecnología Vegetal