Stehberg Liberman, JimmyLinsambarth Salgado, Sergio ArmandoFacultad de Ciencias Biológicas2022-10-112022-10-112019https://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/24230Tesis (Doctor en Biociencias Moleculares)Esta tesis fue financiada por los proyectos UNAB DI-603-14/N and DI-4/17N, FONDECYT N°1160986, CORFO INNOVA 14IDL2-30195, ECOS-CONICYT C15B01.Se ha demostrado que el bloqueo de hemicanales (HCs) de conexina 43 (Cx43) astrogliales en la amígdala basolateral(BLA)afecta la consolidación de la memoria al miedo, efecto que fue prevenido al administrar un cocktail de glio transmisores putativos. Sin embargo, no se determinó el glio transmisor que pasa por los HCs de Cx43 necesario para que la memoria sea consolidada. No obstante, otros estudios in vitro han sugerido que estos canales liberan varias moléculas que podrían participaren la consolidación de la memoria. En base a esto, el objetivo de esta tesis fue identificar los glio transmisores liberados vía HCs de Cx43 astrogliales que son necesarios para la consolidación de la memoria, y determinar cuando estos glio transmisores son putativamente liberados. La hipótesis que sustenta esta tesis es :“La formación de la memoria del miedo a corto y largo plazo requiere de la liberación de glutamato y D-serina en la amígdala basolateral durante el aprendizaje mediada por un aumento en la actividad de hemicanales de conexina 43 astrogliales”.Para comprobar esta hipótesis se utilizó el paradigma de memoria del miedo conocido como cued fear conditioning. Se llevó a cabo el bloqueo de los HCsde Cx43 mediante la microinyección intra-BLA del péptido TAT-Cx43L2, el cual bloque a la actividad de HCs de Cx43sin afectar la actividad de uniones en hendidura de Cx43. La microinyección de TAT-Cx43L2en conjunto conglio transmisores putativos, de forma individual y en combinaciones, mostró que la combinación de glutamato y D-serina fue la única en prevenir el efecto amnésico del bloqueo de los HCs de Cx43. Por otro lado, la administración de TAT-Cx43L2en la BLA previo al entrenamiento produjo déficits de memoria a corto plazo (1 hora post-entrenamiento),que se previnieron con la adición de glutamato y D-serina. La administración del péptido después del entrenamiento no tuvo efecto en la memoria a corto plazo. Finalmente, mediante un ensayo de captación de etidio en rebanadas de BLA, se observó un aumento de la actividad de los HCs de Cx43 en astrocitos 1 hora, pero no 3 horas post-entrenamiento, con un concomitante aumento en el número de astrocitos que aumentan la actividad de sus HCs de Cx43, pero sin afectarla cantidad total de la proteína Cx43en la BLA. Todo lo anterior sugiere que durante el entrenamiento aumenta la actividad de HCs de Cx43 en astrocitos, posiblemente mediando la liberación astroglial deglutamato y D-serina, los que se requieren para la formación de la memoria a corto plazo y consiguiente memoria a largo plazo, pero no para el aprendizaje.Blockade of astrocytic connexin 43(Cx43)hemichannels(HCs)in the basolateral amygdala(BLA)wasshown to impairfear memory consolidation, effect that wasprevented by the administration of a cocktail ofputative gliotransmitters. However, the gliotransmittersreleased via Cx43 HCs that are required for memory consolidation werenot identified.In vitrostudies have suggestedthat Cx43 HCsmediate the release of severalmolecules that couldpotentially participate in memoryconsolidation. Based on the above, the goal of the present thesis wasto determine the gliotransmittersreleased via astroglial Cx43 HCswhich arenecessaryfor memory, and the time point in which thesegliotransmittersareputatively released. The hypothesis that subserves this thesis is:“The formation of short and long-term fear memory requires the release of glutamate and D-serine at the BLA during learning mediated by an increase in the astroglial Cx43 HCs activity”.To test this hypothesis,we used cued fear conditioning as the memory paradigm. Cx43 hemichannel activity was blocked by intra-BLA microinjections ofTAT-Cx43-L2, peptide known to blockCx43 HCswithout affecting Cx43 gap junctions. The micro-infusionof TAT-Cx43L2 togetherwith putative gliotransmitters, individually or in combinations,showed that only the combination of glutamate and D-serine prevented the amnesic effectsof Cx43 HCblockade. When TAT-Cx43L2 was administered before training,it induced short-term memory deficits 1-hour post-training, which were prevented by addition of a combination of glutamate and D-serine.Administration of thepeptide after training hadno effect on short-term memory. Finally, usingethidium uptakesnapshotsin BLAslices, it was found that Cx43 HCsincrease their activity1h, but no 3h post-training, with a concomitant increase in thenumber of astrocytes that increment their Cx43 HC activity, without affecting overall Cx43 expression.All the above suggest that during training, Cx43 hemichannel activity is augmented in astrocytes within the BLA, possibly mediating an increase in astroglial release of glutamate and D-serine, which are required for the formation of short-term memory and subsequent long-term memory, but not for learning per se.esHemicanalesMemoriaTesis