Cubillos Riffo, FranciscoCuevas, Mara PazFacultad de Ciencias BiológicasEscuela de Ingeniería en Biotecnología2017-10-112017-10-112016http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/4326Tesis (Magíster en Biotecnología)Proyecto CONICYT y Programa Nacional Apoyo al Retorno de Investigadores/as desde el Extranjero N°82130010, titulado “Determinación de los polimorfismos en regiones regulatorias que subyacen la adaptación al ambiente en levaduras Saccharomyces Cerevisiae”Proyecto FONDECYT de iniciación N°11140097 titulado “Quantitative genetic analysis of the response to mycotoxins in yeast”Saccharomyces cerevisiae es la mayor responsable del proceso fermentativo debido a su alta tolerancia al etanol. En las últimas décadas, el proyecto de re-secuenciación del genoma de S.cerevisiae (Liti et al., 2009) logró determinar que existe una gran diversidad genética y fenotípica entre cepas de la misma especie. El objetivo general del presente trabajo consiste en identificar variantes alélicas en base a diferencias de expresión alélica especifica (ASE) entre cuatro aislados de S.cerevisiae DBVPG6765 (WE), YPS128 (NA), Y12 (SA), DBVPG6044 (WA), que expliquen variaciones fenotípicas en rasgos enológicos. Para esto, se seleccionaron tres híbridos F1, donde el alelo Wine European estuviese presente [(WE x NA); (WA x WE); (WE x SA)]. Lo anterior, en base a las características específicas que presenta la cepa WE con respecto a la industria vitivinícola. Para la búsqueda de alelos candidatos, se realizó un proceso de selección en un set de 3,315 genes cuantificados por Cubillos y colaboradores (Cubillos et al., 2016), donde fueron seleccionados ADH3, GPD1 y PFK1, como genes candidatos. A través de la técnica de reciprocidad hemicigota, fue posible comparar dos híbridos F1 bajo un mismo fondo genético, a excepción del locus de prueba. Cada híbrido F1 fue expuesto a una condición de mosto sintético para evaluar comportamiento cinético, asimilación de nutrientes y producción de compuestos enológicos. Análisis de las cepas arrojaron diferencias significativas en diversos fenotipos evaluados, siendo uno de los más atractivos la producción de glicerol. Las cepas ADH3SA, WA (quienes contienen el alelo intacto Sake, West African) produjeron mayores niveles de glicerol que la cepa ADH3WE (quien contiene intacto el alelo Wine European). Comparablemente en el caso de las cepas GPD1NA, WA, SA (quienes contienen el alelo intacto North American, West African y Sake), se observó un menor consumo de azúcares fermentables, reducción en la producción de etanol y una mayor producción en los niveles de glicerol, fenotipos que logran repetirse en dos de los genes candidatos, siendo fenotipos que podrían satisfacer las nuevas demandas de la industria vitivinícola de los últimos años. Paralelamente, la cepa PFK1WE (quien contiene el alelo intacto Wine European) en todos los cruces (North American, West African y Sake), tiende a consumir mayor cantidad de azúcares fermentables y a perder 11 más CO2 que las demás cepas en estudio. Sin embargo, la tendencia en perder mayores cantidades de CO2, no se relacionan con la producción de etanol al final de la fermentación, siendo incluso las cepas PFK1NA, SA (quienes contienen el alelo intacto North American y Sake) levemente superiores en este fenotipo. Este trabajo logra seleccionar, evaluar y analizar el comportamiento que poseen diversas variantes alélicas bajo una condición ambiental determinada, logrando concluir que las necesidades celulares y posterior adaptación podría ser una valiosa herramienta para aplicaciones biotecnológicas, incluyendo la elaboración del vino. A su vez el conocimiento y compresión de como variaciones genéticas influyen en la expresión de un determinado gen es objeto importante de investigación.Saccharomyces cerevisiae is one of the main organism responsible of the fermentation process, mostly due to its high ethanol tolerance. In the last decade, the re-sequencing project of the S. cerevisiae genome demonstrated that this species holds a vast genetic and phenotypic diversity between strains. In this context, the main objective of this thesis is to identify allelic variants that can explain phenotypic variation in complex traits based on differences of allele specific expression (ASE) between four isolates of S.cerevisiae: DBVPG6765 (WE), YPS128 (NA), Y12 (SA), DBVPG6044 (WA). For this, three F1 hybrids were selected, where the “Wine European” allele was present [(WE x NA); (WA x WE); (WE x SA)]. The above, based on the specific characteristics that shows in the WE strain beneficial performance for the wine industry. In order to look for candidates alleles, a selection process was performed from a set of 3,315 previously quantified genes by Cubillos and contributors, where ADH3, GPD1 and PFK1 were selected as candidates based on greater expression levels of the WE allele. Utilizing the reciprocal hemizygosity technique, it was possible to compare two F1 hybrids under a single genetic background, except for hemizygosity in the locus being evaluated. Each F1 hybrid was grown in synthetic wine must to evaluate kinetics behavior, nutrient uptake and production of oenological compounds. Analysis of each reciprocal hemizygotes (RH) showed significant differences for several phenotypes, being one of them: glycerol production. The ADH3SA, WA RH (those that contain the intact Sake and West African allele, respectively) produced greater glycerol levels than the ADH3WE RH (which contains the intact Wine European allele). Similarly, in the case of GPD NA, WA, SA strains, a lower consumption of fermentable sugars, reduced ethanol production and higher glycerol production was observed, representing phenotypes that could satisfy the new demands of the wine industry. In parallel, the PFK1WE RH tended to consume greater amounts of fermentable sugars and lose more CO2 than the other RHS in all the crosses evaluated (North American, West African and Sake). However, the tendency to lose greater levels of CO2, is unrelated with ethanol production at the end of the fermentation, where even PFK1NA,SA strains were slightly better for this phenotype. This work was able to select, evaluate and analyze the behavior of different allelic variants under a certain environmental condition, concluding that the cell needs and subsequent adaption could be a valuable tool for biotechnological applications, including winemaking. Finally, the knowledge and understanding of how genetic variants influence gene expression, is an important object of investigation.esSaccharomyces CerevisiaeIndustria VitivinícolaBiotecnología AlimentariaTesis