Rosemblatt S., MarioAlarcón (Moore) Numhauser, Carolina Graciela2017-12-072017-12-072010http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/4827Tesis (Doctor en Biociencias Moleculares)La regulación inmune o inmunosupresión desempeña un papel trascendental en trasplante de órganos donde los linfocitos T reguladores (Tregs) son piezas claves de la compleja estructura de la respuesta inmune. Los linfocitos T reguladores naturales CD4+ CD25+ Foxp3+ (nTregs) representan el 5-10% de los linfocitos T CD4 periféricos, y estudios en ratón han demostrado que estas células son reguladores esenciales en la mantención de la tolerancia inmunológica. En los últimos años los avances en la caracterización de Tregs han sido vertiginosos, sobre todo por el descubrimiento de la relevancia del factor de transcripción Foxp3. Se ha observado que en determinadas condiciones in vitro, linfocitos T vírgenes CD4+ CD25- Foxp3- se pueden convertir en linfocitos T reguladores inducibles Foxp3+ (iTregs) mediante diversos protocolos de conversión y/o expansión . Estos protocolos generalmente involucran la estimulación de linfocitos T bajo diferentes condiciones, en presencia de citoquinas agregadas de manera exógena entre las cuales el factor de crecimiento transformante-beta (TGF-13) ha demostrado desempeñar un papel crítico. Los iTregs generados mediante diferentes protocolos se caracterizan por la expresión Foxp3 y la capacidad de inhibir la proliferación de las linfocitos T efectores in vitro. También se ha demostrado que estas células Foxp3+ generadas ex vivo pueden regular las respuestas de los linfocitos T in vivo luego de su transferencia adoptiva en receptores inmunodeficientes. La utilización de Treg generados o expandidos ex vivo podría tener un potencial significativo en el trasplante de órganos pudiéndose utilizar como terapia celular. Sin embargo, el éxito de este enfoque depende de diversos factores tales como la generación de Treg en un número suficiente, la estabilidad de la expresión Foxp3, la sobrevida in vivo después de la transferencia adoptiva, la adecuada migración in vivo , y la capacidad de suprimir efectivamente la respuesta inmune asociada al rechazo del trasplante. Por otro lado, metabolitos de la vitamina A, incluyendo el ácido retinoico (RA), se une a receptores nucleares relacionados con RA que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. In vitro el RA aumenta la señalización de TGF-(3 mediante el aumento de la expresión y la fosforilación de Smad3, traduciéndose en un incremento en la expresión de Foxp3 aún en presencia de citoquinas que llevan a la generación de Th17 como IL-6 o IL-21. Tomando en cuenta estas consideraciones hemos desarrollado un novedoso protocolo en el cual linfocitos T vírgenes CD4+ CD25- Foxp3- son estimulados con células presentadoras de antígeno alogénicas, en presencia de IL-2, TGF-(3 y RA, resultando en una fuerte inducción de la expresión de Foxp3 . Estas células, a las cuales hemos denominado como RA-Tregs presentan los marcadores característicos de Tregs y una potente actividad inmunosupresora in vitro. La caracterización mediante citometría de flujo de los RA-Tregs muestra una población que expresa diferentes moléculas, característicos de una gran capacidad supresora además de la habilidad de migrar a sitios de aloreactividad , lo cual hemos comprobado mediante diferentes modelos murinos de trasplante. Así luego de su transferencia adoptiva los RA-Tregs previenen de forma antígeno específica el rechazo de aloinjertos de piel en receptores inmunodeficientes. De la misma forma los RA-Tregs son capaces de prolongar la vida de un aloinjerto cardíaco en receptores inmunocompetentes en combinación con dosis subterapéuticas de CTLA-4 lg, un medicamento utilizado para prevenir el rechazo. En su conjunto los resultados muestran que este protocolo permite la generación de novo de Tregs mediante el ca-cultivo de linfocitos T vírgenes con células presentadoras de donantes en presencia de IL-2, TGF-(3 y RA, y que estas células son capaces de extender la sobrevida de injertos de piel y corazón alogénicos de manera antígeno específica. La generación de RA-Tregs representa un nuevo enfoque de gran alcance para generar Treg aloantigeno específicos con gran capacidad supresora in vivo.lmmune regulation or immunesuppression has long been proposed to play an important role in transplantation where various types of regulatory T cells (Tregs) have been documented in transplant models. Naturally occurring CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (nTregs) represent 5-10% of peripheral CD4 T cells, and recent studies in the mouse have shown that these cells are critica! regulators of immune tolerance. In recent years progress in characterizing many of these cell types has been rapid , most notably by discovery of the relevance of the transcription factor Foxp3. lt is established that under specific conditions na'fve CD4+CD25-Foxp3- T cells can be converted into Foxp3+ inducible regulatory T cells (iTregs) and severa! conversion/expansion protocols have been described . Such protocols usually involve T cell stimulation under conditions of cytokine modification where transforming growth factor-beta (TGF-f3) has been shown to play a critica! role. Resultant populations are characterized by the expression of Foxp3 and the ability to inhibit the proliferation of effector T cells in vitro. Critically, severa! studies have shown that these ex vivo generated Foxp3+ cells can regulate T cell responses in vivo following adoptive transfer into immunodeficient recipients . Clearly, ex vivo generated/expanded Treg generated from the recipient T cells and returned to the patient like cellular therapy could have significant potential in transplantation. However, the success of this approach depends on severa! factors such as generating Treg in sufficient numbers, preservation of Foxp3 expression, survival in vivo after infusion, appropriate homing in vivo, and the ability to provide a predictable suppression of rejection responses. On the other hand, it has been shown that vitamin A metabolites, including retinoic acid (RA), form ligands for retinoic acid-related nuclear receptors that play important roles in severa! biological processes. Recently, it has been demonstrated that in vitro RA enhances TGF-f3 signaling by increasing the expression and phosphorylation of Smad3. This results in an increased Foxp3 expression even in the presence of Th17 inducing cytokines such as IL-6 or IL-21. We have developed a novel protocol in which naive CD4+CD25-Foxp3- T cells are stimulated with allogeneic antigen-presenting cells in the presence of IL- 2, TGF- ~ and retinoic acid. This result in the induced expression of Foxp3 and more importantly, these cells (denoted as RA-Tregs), has potent immunosuppressive activity in vitro. The characterization of these RA-Tregs show these cells have high suppressive capacity and are capable of migrating to sites of alloreactivity, which we have successfully demonstrated given that RA-Tregs are capable of preventing , in an antigen specific manner, the rejection of skin allografts after their adoptive transfer into immunodeficient recipients . Moreover, experiments where RA-Tregs were administered to immunocompetent recipients of cardiac allograft in combination with subtherapeutic doses of the immunosuppressant CTLA-4 lg, were able to prolong the life of the allograft. Overall our results show that the ca-culture of na'lve T cells with donorpresenting cells in the presence of TGF- ~ and RA generates de novo Tregs, that are able to extend the survival of allogeneic skin and heart grafts in an antigen specific manner. Therefore, the generation of RA-Tregs represents a powerful new approach to generate alloantigen-specific Treg with suppressive capacity in vivo.esLinfocitos TInmunologíaTrasplanteTolerancia InmunológicaTesis