Moreno Vilches, Adrián AndrésAlegría Muñoz, Silvia RosyFacultad de Ciencias de la VidaEscuela de Ingeniería en Biotecnología2024-10-302024-10-302019https://repositorio.unab.cl/handle/ria/61670Memoria de Título (Ingeniero en Biotecnología)Las proteasas romboides corresponden a serinas proteasas intermembrana, las cuales son capaces de procesar sus sustratos en el plano de la bicapa de la membrana. Además, es posible encontrarlas en casi todos los organismos. Sin embargo, no hay información sobre posibles sustratos para alguna proteasa romboide de origen vegetal. Recientemente, se ha postulado que AtbZJP60u sería un sustrato de este tipo de proteasas, ya que migra hacia el núcleo bajo tratamiento con 300 mM de manito) y se sugiere que tiene la capacidad de regular la expresión génica de genes blancos distintos a los asociados a la vía del UPR. Previamente, se ha reportado que AtRBL13, AtRBL14 y AtRBL15 comparten una homología de secuencia de aminoácidos significativa con la proteasa romboide humana HsRHBDL4, la cual se encuentra localizada en el retículo endoplasmático y es regulada durante el estrés de este organelo. Además, se ha determinado que la localización subcelular de AtRBLJ 4 corresponde a la membrana del retículo endoplasmático. Sabiendo esto, se determinó la incidencia de la ausencia de las proteasas romboides sobre la expresión de los genes blancos del factor de transcripción de AtbZJP60u bajo condiciones de estrés osmótico, inducido con manito) o sorbitol. Para ello, se realizó una selección de mutantes, de manera de obtener una línea homocigota para la inserción de T-DNA en las secuencias codificantes de los genes AtRBLJ 3 y AtRBLJ 5, y se analizó el efecto de esta mutación en la expresión de los genes blancos de AtbZIP60u, AtOPCL y AtAFP3, mediante RT-qPCR, donde se observó que si tienen una respuesta diferente a nivel de transcrito respecto de plantas silvestres. El análisis de fenotipo en estas mismas mutantes AtRBLJ 3 y AtRBLJ 5 evidenciaron la existencia de variaciones a nivel fisiológicos en las plantas sometidas a estrés osmótico con mutaciones insercionales en estas proteasas, respecto de lasplantas silvestres sometidas al mismo tipo de estrés. Algunos cambios observados corresponden a cambios de color, tamaño de las plantas, viabilidad de semillas y el crecimiento de vástago temprano. En suma, a través de este trabajo experimental fue posible determinar que líneas mutantes en las proteasas romboides AtRBLJ 3 y AtRBLJ 5 presentan un desarrollo distinto, respecto de plantas silvestres expuestas a condiciones de estrés osmótico y la expresión de genes blanco de AtbZJP60u se ve alterada en estas plantas, sugiriendo que estas proteasas tendrían un rol en el procesamiento proteolítico de AtbZJP60u bajo estas condiciones.Rhomboid proteases are intermembrane serine proteases capable of process ing substrates in the Iipid bilayer plane, and are found in almost every known organism. However, there is no information regarding substrates for plant rhomboid proteases. According to recent findings, AtbZIP60u could be a substrate for said these type ofproteases, and it is found that under 300 mM manito! treatment the protein migrates to the nucleus and regulates expression of target genes different from those asociated to response UPR. Previously, it has been reported that AtRBLI 3, AtRBLJ 4 and AtRBLI 5 share significative aminoacidic homology to the human rhomboid protease HsRHBDL4, which is found to be anchored to the endoplasmatic reticulum and is regulated during stress of said organelle. Also, it is known that A tRBLJ 4 is localized in the endoplasmatic reticulum membrane. Knowing this, the effect of absence of rhomboid proteases over the expression of AtbZIP60u target genes was determined under osmotic stress conditions. For this assay mutant plants were selected to obtain homozygous lines for T-DNA insertions in AtRBLJ 3 and AtRBLI 5, and to analyze it effect over the expression of target genes AtOPCL and AtAFP3 through RT-qPCR, where differential expression compared to wild type plants was observed. Phenotype analysis of the same mutant plants indicated the existence of variations at a physiological leve! in this plants under osmotic stress compared to wild type plants under the same conditions. In summary, through this experimental work it was possible to determine which mutant lines for rhomboid proteases AtRBLI 3 and AtRBLI 5 exhibit differences in development respect to wild type plants exposed to the same conditions of osmotic stress. In addition, the alterations in expression of AtbZIP60u target genes in these mutants was also assessed, suggesting that these rhomboid proteases have a role in the proteolytic processing of AtbZJP60u under osmotic stress.esEstrés OsmóticoMutación en PlantasArabidopsis thalianaTesis