Varela, DiegoHermosilla, TamaraAcevedo Harnecker, Alejandra JesúsFacultad de Ciencias BiológicasEscuela de Ingeniería en Biotecnología2018-08-312018-08-312017http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/6864Tesis (Ingeniero en Biotecnología)La respuesta de lucha o huida, particularmente a nivel cardiaco, induce un aumento en la contractibilidad y frecuencia cardiaca producto de la activación de los receptores β-adrenérgicos y del aumento en la actividad de PKA. En el musculo cardiaco, la entrada de calcio (Ca2+) al citoplasma es fundamental para el proceso de contracción, el cual se inicia mediante el influjo de este ion a través de los canales de calcio de tipo L (LTCC) ), los cuales están compuestos por una subunidad formadora de poro conocida como CaV1.2 (que permite la entrada de Ca2+ al citoplasma) y dos subunidades auxiliares denominadas CaVα2δ1 y CaVβ2, cuya función está relacionada con el transporte y la permanencia del canal en la membrana. A su vez, la subunidad CaVβ2 posee 5 variantes que difieren en el sitio de inicio de la transcripción (conocidas como variantes CaVβ2–TSS), las cuales sólo difieren en la composición y en la longitud del dominio N-terminal. Estas variantes CaVβ2–TSS, al ser sobre-expresadas en cardiomiocitos de ratas neonatas, incrementan las corrientes de tipo L endógenas de la célula en diferente medida, dependiendo de la subunidad sobre-expresada, además de modificar la cinética de activación/inactivación de los LTCC, otorgando una probabilidad de apertura (Po) diferencial a estos canales. Por otro lado, la activación del sistema nervioso simpático genera la liberación de diversas catecolaminas, las cuales activan a los receptores β-adrenérgicos, los que forman parte de la familia de receptores acoplados a proteína G (GPCR’s). La activación de estos receptores eleva los niveles de cAMP, lo que produce la estimulación de la proteína quinasa A (PKA), la cual fosforila a diversas proteínas, entre ellas, residuos clave en el dominio C-terminal del canal Cav1.2. El canal Cav1.2 sufre una serie de modificaciones post-traduccionales, entre las cuales destaca el procesamiento proteolítico del dominio C- terminal, el cual es luego reasociado al extremo distal del canal, formando un complejo de señalización auto-inhibitorio que es necesario para la correcta regulación de los LTCC. Cabe destacar que para que el canal Cav1.2 sea capaz de responder al estímulo β-adrenérgico es necesario que el extremo C-terminal del canal esté procesado proteolíticamente. La hipótesis más aceptada es que durante la respuesta de lucha o huida, una vez activados los receptores β-adrenérgicos, las fosforilaciones mediadas por PKA en el extremo C-terminal generarían una desestabilización del complejo auto-inhibitorio, desplazándolo y de este modo, generando un incremento de las corrientes de Ca2+ tipo L, como parte de la respuesta de lucha o huida, aumentando fundamentalmente la Po. Como fue mencionado anteriormente, las diferentes variantes CaVβ2–TSS afectan diferencialmente la cinética de activación e inactivación del canal y también la Po. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue determinar cómo las diferentes variantes CaVβ2–TSS son capaces de modular los LTCC durante la respuesta β-adrenérgica. Nuestra hipótesis propone que la regulación de los LTCC, durante la respuesta β-adrenérgica, depende tanto de la modulación diferencial de la Po, por parte de las diferentes variantes CaVβ2–TSS, así como también de la cantidad de canales que estén procesados proteolíticamente, de modo que, durante la respuesta β-adrenérgica, el complejo auto-inhibitorio pueda ser desplazado, permitiendo un mayor influjo de Ca2+. Nuestros resultados demuestran por un lado, que la estimulación de cardiomiocitos de ratas neonatas con forskolina genera un aumento, en promedio de 3 veces, en las corrientes de tipo L y además, que la cinética de inactivación del canal Cav1.2 se ve modificada. Asociado a lo anterior, fue observado que la sobre-expresión de las variantes CaVβ2–TSS produce un incremento en las corrientes de tipo L y un desplazamiento del potencial de activación (Va) hacia valores hiperpolarizantes, es decir, hacia potenciales más negativos. Sin embargo, al agregar forskolina y sobre-expresar las variantes CaVβ2–TSS, contrario a lo esperado, no fue observado un aumento significativo de las corrientes ni tampoco cambios en el Va, lo cual sugiere que la sobre-expresión de estas variantes disminuiría la respuesta a forskolina dado que la sobre-expresión per se de las variantes CaVβ2–TSS estaría generando un desplazamiento en el Va, lo cual posiblemente sería producto de que, al estar estas variantes sobre-expresadas , la razón CaV1.2: CaVβ2 cambia, de modo que la subunidad CaVβ2 podría unirse a un sitio de baja afinidad en el dominio C-terminal del canal CaV1.2 induciendo el desplazamiento del fragmento reasociado y eliminando el efecto auto-inhibitorio, por tanto, al agregar forskolina, no son generados cambios significativos sobre las corrientes puesto que el dominio C-terminal estaría pre-desplazado y por lo tanto, no sería posible un nuevo desplazamiento, lo cual explicaría la ausencia de activación. Cabe destacar que esta situación podría generarse durante estados fisiopatológicos del corazón, donde al disminuir la cantidad de canales presentes en la célula (por ejemplo durante la falla cardiaca), aumentaría la razón de subunidades CaVβ2, disminuyendo la capacidad de respuesta al estimulo β-adrenérgico.esCardiopatíasTratamientoReceptores Adrenérgicos BetaCanales de CalcioTesis