Rosemblatt, MarioAllende, MiguelWilhelm, VivianRubio Ahumada, Solange2021-01-212021-01-212013http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/17635Tesis (Doctor en Biociencias Moleculares)El pez cebra como modelo ofrece diversas ventajas para el estudio del sistema inmune tanto innato como adquirido entre las que se cuentan su transparencia en los estadios iniciales del desarrollo, fácil manipulación y la disponibilidad de poderosas metodologías genéticas y moleculares. Se ha descrito que los peces poseen células con características similares a los linfocitos B y T de otros vertebrados. Dadas las ventajas mencionadas, el pez cebra es un buen modelo para estudiar estas poblaciones linfoides. Sin embargo, un inconveniente importante en este campo es la falta de herramientas inmunológicas tales como anticuerpos monoclonales que permitan aislar diferentes linajes linfoides y así poder caracterizar estos componentes celulares del sistema inmune de teleósteos. Aunque, aparentemente, muchos de los elementos esenciales del sistema inmune adquirido entre mamíferos y teleósteos son conservados, existen diferencias entre ellos, como la ausencia de médula ósea en los peces, cuya función como órgano hematopoyético en mamíferos, es desempeñada por el riñón en los teleósteos. Es en el riñón donde podemos encontrar linajes hematopoyéticos similares a los de médula ósea de mamíferos. Por otro lado y en contraste a lo que ocurre en mamíferos, los peces tienen sólo cuatro tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgZ e IgT. Entre estas, la IgM es la única que desempeña un papel importante en la respuesta inmune humoral de los teleósteos. Además de ser la inmunoglobulina más abundante en el suero de los peces, se encuentra presente en la superficie celular de los linfocitos B, lo cual permite usarla como marcador para esta subpoblación linfoide. A pesar de los antecedentes descritos, los linfocitos B de teleósteos están pobremente caracterizados, por lo cual, el objetivo de este trabajo fue avanzar en la caracterización de los linfocitos B en el pez cebra. Para ello utilizamos un anticuerpo monoclonal anti-IgM de salmónido, preparado previamente y establecimos que reconoce esta inmunoglobulina también en pez cebra. Por otro lado, aprovechamos la isponibilidad de distintas líneas de pez cebra transgénicas, entre ellas: rag2::GFP, que permite identificar linfocitos inmaduros, mhc2dab::GFP que marca células presentadoras de antígeno y cd45::DsRed, que marca una subpoblación de células mieloides y linfocitos T. Con estas herramientas, separamos las distintas subpoblaciones linfoides, mediante cell sorting y analizamos, a través de PCR en tiempo real, la expresión de los marcadores linfoides IgM, pax5 (gen clave en la diferenciación del linaje B), rag2 (determinante en el proceso de recombinación génica en linfocitos B y T) y Ick (codifica para una kinasa presente sólo en linaje T). Finalmente, aislamos las células I~My+ a nalizamos la habilidad de estas células de fagocitar material inerte y bacterias. En este estudio se logró identificar células I~M' en riñón, bazo y sangre de peces cebra adultos. Mediante citometría, demostramos que alrededor del 4% de todas las células renales presentan la expresión de IgM en la superficie celular. Estas células constituyen una subpoblación de linfocitos B, como se indica por los análisis de expresión de genes pax5 e IgM y la co-expresión del transgén mhc2dab::GFP. Además, se identificaron las células I ~ M a+is ladas a partir de riñón de la línea transgénica rag2::GFP (que marca las células progenitoras linfoides) lo que permitió discriminar subconjuntos discretos de diferentes estados de desarrollo de las células B (estadios del linaje B inmaduros y maduros). Además, se observó, a través de citometría de flujo y microscopía fluorescente, que las células que fagocitan micropartículas de poliestireno o bacterias, no expresan IgM en su superficie y no pueden ser identificadas como linfocitos B como se ha reportado en trucha y salmón. Haber identificado y separado linfocitos B en pez cebra es un logro que contribuye a nuestra comprensión del sistema inmune adaptativo de este teleósteo y que nos permitirá en un futuro aplicar este conocimiento a otras especies de teleósteos, incluyendo aquellas de interés comercial.The zebrafish model offers many advantages for the study of both the innate and adaptive immune systems due to its transparency in early developmental stages, ease of manipulation and a sequenced genome. However, a major downside in this model system is the lack of tools such as monoclonal antibodies that would allow the isolation of different lymphoid lineages and thus permit the characterization of the cellular components of the teleost immune system. Severa! reports from the literature indicate that fish have cells with characteristics similar to B and T lymphocytes present in other vertebrates. Due to these advantages, the zebrafish represents a good model to study the lymphoid populations in teleosts. Severa! critica! aspects of the adaptive immune system seem to be conserved between mammals and teleosts. However, there are important differences among them, such as the absence of a bone marrow in fish, where the kidney is the main hematopoietic organ. In the kidney of fish we find the same hematopoietic lineages present in the mammalian bone marrow. Furthermore, teleost fish have only four types of immunoglobulins lgM, IgD, IgZ and lgT. Among these, IgM is the only inmonoglobulin that has been reported to play a role in the teleost humoral immune response. It is the most abundant immunoglobulin in fish serum and it is present on the cell surface of B lymphocytes, providing a convenient marker for this lymphoid subpopulation. Despite this, the B lymphocytes of teleosts are still poorly characterized. The objective of this study was to characterize B lymphocytes in the zebrafish. First, we used an anti-IgM monoclonal antibody generated against salmonid lgM and we found that it also recognizes this immunoglobulin in zebrafish. W e also took advantage of the availability of different transgenic zebrafish lines: rag2::GFP that identifies immature lymphocytes, cd45::DsRed, which marks subpopulation of T cells and myeloid cells and mhc2dab::GFP, which identifies antigen presenting cells. A second approach was to separate the lymphoid subpopulations and identify them by cell sorting and analysis through real time PCR. We examined the expression of the lymphoid markers JgM, pax5 ( a key gene in B lineage differentiation), rag2 (the enzyme that carries out gene recombination in B and T lymphocytes) and lck (encoding a kinase present only in the T cell lineage). The IgM+ cells were also identified by immunocytochemistry and by the ability of these cells to phagocytose inert material or bacteria. Our results allowed the identification of IgM+ cells in kidney, spleen and blood of adult zebrafish after labeling with the monoclonal antibody against salmonid IgM. By flow cytometry, 5% of all kidney cells showed expression of cell surface IgM. These cells constitute a subpopulation of B lymphocytes, as indicated by gene expression analysis (JgM, pax5) and co-expression of the transgene mhc2dab::GFP. In addition, the identification of IgM+ cells among kidney cells isolated from the rag2: :GFP transgenic line that marks lymphoid progenitor cells, allowed discrimination of developmental stages among subsets of B lymphocytes (stages of immature and mature B cells). Moreover, by flow cytometry and fluorescence microscopy, we demonstrate a group of cells that phagocytosed bacteria or polystyrene microspheres do not express IgM on their cell surface and cannot be identified as B lymphocytes as reported for trout and salmon. Being able to identify and separate B lymphocytes in zebrafish is an achievement that contributes to our understanding of the adaptive immune system of the teleost, focusing on the role the B cells play in the zebrafish immunity, knowledge that could be applied to species of commercial interest.esPez CebraLinfocitos BEstudio inmunológicoMetodologías genéticas y molecularesChileTesis