Vera Junemann, María InésQuezada Monrás, Claudia Andrea2021-12-102021-12-102005http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/21260Tesis (Doctor en Biociencias Moleculares)En células eucariotas existen compartimentos subnucleares cuyas funciones no han sido claramente establecidas. Entre estos compartimentos el mejor caracterizado es el nucléolo, el cual se constituye a partir de las regiones organizadoras del nucléolo (NOR), correspondientes a cromatina que contiene el DNA ribosomal (rDNA) presente en determinados cromosomas, y factores que regulan la síntesis de los ribosomas. La etapa de mayor importancia en la actividad nucleolar es la transcripción del rDNA, la cual puede ser regulada en respuesta a diferentes estados de diferenciación ó del ciclo celular, y por la disponibilidad de nutrientes, factores hormonales ó condiciones ambientales que afecten la función sistémica de un organismo. Estudios en la carpa (Cyprinus carpio) indican que durante la aclimatización estacional a invierno de este pez, ocurre una segregación de los componentes nucleolares, lo cual refleja morfológicamente una inactivación temporal de la expresión de los genes ribosomales. Actualmente se postula que nucleolina, la proteína más abundante del nucléolo, participa en diversas etapas de la biogénesis ribosomal, siendo particularmente interesante su función que la involucra en regular la transcripción del cistrón ribosomal. Nuestra propuesta de estudio contempló asociar la actividad de nucleolina con la expresión de los genes ribosomales utilizando un modelo in vivo de inactivación transitoria de la función nucleolar. Por ello planteamos como hipótesis que nucleolina sería uno de los factores implicados en la modulación de la síntesis de rRNA durante la aclimatización del pez C. carpio. Identificamos en la carpa la expresión de tres cDNAs que codifican para isoformas de nucleolina, las cuales contienen regiones acídicas adicionales a las presentes en la proteína de mamíferos y que representan la expresión de distintos genes. La organización de uno de los genes de nucleolina revela que el mayor contenido de regiones acídicas en las proteínas de carpa son codificadas por exones adicionales. Al igual que en mamíferos el gen de carpa codifica los snoRNAs U20, U23 y U82 en algunos de sus intrones. El promotor proximal del gen de nucleolina de carpa contiene elementos regulatorios semejantes a los del genes constitutivos en mamíferos, tales como una caja tipo TATA, tres regiones ricas en bases pirimidínicas y además varios sitios potenciales de unión a factores de transcripción como GATA, Myc, Mef-2, LSF y ERE. Mediante Northern blot e inmunocitoquímica, determinamos que la expresión estacional de nucleolina en hígado de carpa es significatiamente mayor en mv1erno, consecuente con su papel como represor de la transcripción del rRNA El mayor contenido de nucleolina en esta estación se debe a un incremento en la expresión de los genes NUCl y NUC3. Mientras que el contenido del mRNA cNUC2 no es influenciado por las condiciones del ambiente. Además, determinamos que la función de nucleolina podría ser regulada a través de una mayor expresión en invierno de isoformas fosforiladas de la proteína y por la interacción diferencial con factores nucleares con los cuales coinmunoprecipita estacionalmente. Nuestros resultados apoyan la hipótesis que nucleolina participaría en la represión de la transcripción del rRNA, debido a un mayor contenido y a una actividad regulada por fosforilación y la interacción con distintos factores nucleares, que se traduce en una inactivación temporal de la síntesis de ribosomas durante la adaptación a invierno del pez C. carpio.Eukaryotic cells have sub nuclear compartments whose functions have not been established completely. Among these compartments, the best characterized is the nucleolus, which is formed from nucleolar organizing regions (NOR), corresponding to chromatin that contains the ribosomal DNA (rDNA) present in sorne chromosomes, and factors that regulate the synthesis of ribosomes. The most important stage in nucleolar activity corresponds to rRNA transcription, which can be regulated in response to different stages of di:fferentiation or cell cycle, and by the availability of nutrients, hormonal factors or environmental conditions that affect the systemic function of an organism. Studies in carp (Cyprinus carpio) show that during stational acclimatization to winter, nucleolar components segregate, which morphologically reflects a temporary inactivation of ribosomal gene expression. Currently it has been proposed that nucleolin, the most abundant protein in the nucleolus, participates in various stages of ribosomal biogenesis, being particularly interesting the function that involves it in the cistron ribosomal transcription regulation. Our study proposes to associate the activity of nucleolin with the expression of ribosomal genes using an in vivo model of temporary inactivation of nucleolar function. Therefore, we hypothesise that nucleolin would be one of the factors implicated in the modulation ofrRNA synthesis during acclimatization ofthe :fish C. carpio. We identi:fied in carp the expression of three cDNAs that encoded nucleolin isoforms, which contained additional acidic regions to the ones present in the protein of mammals, which represent the expression of different genes. The organization of one of the nucleolin genes revealed that the largest number of acidic regions was encoded by additional exons. As in mammals, the carp gene encodes the snoRNAs U20, U23 and U82 in sorne of its introns. The proximal promoter of the carp nucleolin gene contains regulatory elements similar to the constitutive genes of mammals, such as a TAT A-like box, three regions rich in pyrimidinic bases and several potential transcription factor binding sites such as GATA, Myc, Mef-2, LSF and ERE. Through Northem blot and immunocytochemistry, we established that the seasonal expression of nucleolin in carp liver is significantly larger during winter, consequent with its role as a repressor of rRNA transcription. The largest content of nucleolin in this season is due to an increase in the expression of the NUC 1 and NUC3 genes. At the same time, the cNUC2 mRNA content is not affected by the environmental conditions. Furthermore, we established the function of nucleolin could be regulated through a larger expression during winter of the phosphorylated isoforms of the protein and by the differential interaction of nuclear factors , with which it co-immunoprecipitates seasonally. Our results support the hypothesis that nucleolin participates in the repress1on of rRNA transcription, due to a larger content and an activity regulated by phosphorylation and the interaction of various nuclear factors, which translates into a temporary inactivation of ribosomal synthesis during the adaptation to winter in the fish C. carpio.esPez carpaActividad nucleolarGenéticaChileTesis