Simon, FelipeEcheverría Echeverría, César Antonio2021-06-302021-06-302013http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/19228Tesis (Doctor en Biociencias Moleculares)La disfunción endotelial es crucial en la patogenicidad del síndrome séptico derivado de una endotoxemia. Es aceptado que el lipopolisacárido (LPS) induce disfunción endotelial a través de la activación del sistema inmune. Sin embargo, el LPS también puede generar cambios directos en las células endoteliales (CE) en la ausencia de células del sistema inmune. Aunque las interacciones entre el LPS y CE provocan muerte endotelial, una porción significativa de CE son resistentes a la muerte inducida por LPS. Las CE que son resistentes al LPS exhiben una morfología típica de fibroblasto, sugiriendo que estas CE entran en un programa fibrótico en respuesta al LPS, a través de un proceso conocido como transición endotelio-mesenquimal (EndMT). No obstante, los mecanismos moleculares que le confieren resistencia a las CE frente al LPS, son desconocidos. El aumento en la concentración de calcio intracelular es fundamental para la generación de la fibrosis. En estesentido, la fibrosis cardiaca es mediada por el canal permeable a calcio TRPM7 (transient receptor potential melastatin 7). Por otra parte la concentración de calcio intracelular es regulada por el canal catiónico no-selectivo TRPM4. Además, ambos canales son modulados por especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales son moléculas generadas durante los procesos inflamatorios como la endotoxemia. De esta forma, estos canales surgen como potenciales candidatos para participar en la fibrosis de CE inducida por LPS. Sin embargo, la participación los canales TRPM7 y TRPM4 en este proceso no se ha estudiado. El objetivo de esta tesis fue investigar si el LPS es capaz de inducir fibrosis endotelial en la ausencia de células del sistema inmune y explorar la participación de los canales TRPM7 y TRPM4 en este proceso. Los resultados mostraron que las CE tratadas con LPS exhiben una disminución de sus marcadores endoteliales CD31 y VE-caderina, y un aumento de los marcadores fibróticos a-SMA, FSP-1, fibronectina y colágeno tipo 111. Estos cambios fueron dependientes de los receptores foil like receptor-4 (TLR4) y activin like kinasa-5 (ALK5), de la vía de señalización de Smad3, y de la generación de ROS producido por la enzima NAD(P)H oxidasa (NAD(P)Hox). Adicionalmente, el canal TRPM7 participa de forma directa en la fibrosis de CE inducida por la endotoxina. El LPS estimuló el aumento de calcio intracelular en un proceso mediado por la expresión de TRPM7. Además, la inhibición de este canal previno la conversión fibrótica estimulada por la endotoxina. Finalmente, la inhibición de la expresión del canal TRPM4 promovió el proceso de fibrosis de las CE. Las conclusiones principales son que el LPS es capaz de generar fibrosis endotelial, en ausencia de células del sistema inmune, dependiente de las vías intracelulares TLR4/NAD(P)Hox/ROS, y ALK5/Smad3. Además, la inhibición de la expresión del canal iónico TRPM7 genera protección frente al estímulo fibrótico, mientras que la inhibición de la expresión de TRPM4 promueve la fibrosis. Estos hallazgos son útiles para mejorar los actuales tratamientos contra el síndrome séptico durante un endotoxemia y otras enfermedades inflamatorias.Endothelial dysfunction is crucial in endotoxemia-derived sepsis syndrome pathogenesis. lt is well accepted that lipopolysaccharide (LPS) induces endothelial dysfunction through immune system activation. However, LPS can also directly generate detrimental effects in endothelial cells (ECs) in the absence of immune cells. Although interactions between LPS and ECs evoke endothelial death, a significant portian of ECs are resistant to the death induced by LPS. LPS-resistant ECs exhibit a fibroblast-like morphology, suggesting that these ECs enter in a fibrotic program in response to LPS, through a process known as endothelium to mesenchymal transition (EndMT). However, the mechanism that confers endothelial resistance to LPS is not known. Considering that the change in the intracellular calcium concentration is important to generate fibrosis, we were prompt to study the role the transient receptor channel melastatin 7 (TRPM7), which is involved in the activation of cardiac fibroblasts, and the TRPM4 non-selective cation channel which controls the intracellular Ca2+ concentration. Furthermore, both channels are modulated by reactive oxygen species (ROS), molecules generated during the inflammatory processes as endotoxemia. Thus, these two channels appear as excellent candidates to be involved the LPS­induced CE fibrosis. However, the role of TRPM7 and TRPM4 channels in this process has not been studied. The aim of this thesis was to investigate whether LPS is able to induce endothelial fibrosis in the absence of immune cells and explore the participation of the TRPM7 y TRPM4 channels in this process. Our results showed that LPS-treated ECs exhibited a downregulation of endothelial markers CD31 and VE-cadherine. In contrast, an up-regulation of fibroblast­specific genes a-SMA and FSP-1, as well as a severe increase in extracellular matrix proteins secretion fibronectin and collagen type 111 was observed. These changes were dependent on the activity of the toll like receptor 4 (TLR4 )/NAD(P)Hox/ROS, and activin like kinase 5 (ALK5)/Smad3 signaling pathways. Furthermore, the TRPM7 calcium channel participates in the endothelial fibrosis induced by LPS. The endotoxin increases the intracellular Ca2+ in a mechanism dependent on TRPM7. Noteworthy, Downregulation of this channel inhibited the LPS-induced ECs fibrosis .. On the other hand, inhibition of TRPM4 ion channel expression induced ECs fibrosis. The principal conclusions are that LPS induces endothelial fibrosis in the absence of immune cells. This is dependent on TLR4-NAD(P)Hox and ALK5-Smad3 intracellular pathways. Furthermore, suppression of TRPM7 ion channel expression protects ECs upon LPS challenge, whereas the inhibition of TRPM4 ion channel expression prometes the fibrosis process. These findings could be useful to improve current treatment against endotoxemia-derived sepsis syndrome and other inflammatory diseases.esCanales IónicosLipopolisacáridosFibrosisSíndrome sépticoMejora Contínua de tratamientosTesis