Fuentes Aravena, JuanTalamilla Espinoza, AndreaFacultad de Ciencias BiológicasEscuela de Ingeniería en Biotecnología2018-06-132018-06-132017http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/6049Tesis (Magíster en Biotecnología)Esta Tesis se realizó en el Laboratorio de Genética y Patogénesis Bacteriana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello y fue financiada por el Proyecto FONDECYT 11121506Salmonella Typhi (S. Typhi), agente causal de la fiebre tifoidea, infecta exclusivamente al ser humano. A pesar de que se encuentra estrechamente relacionada con Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium), difieren en la especificidad de hospedero. Estas diferencias responden a un proceso evolutivo multifactorial que depende de la ganancia de funciones, la perdida de funciones y la regulación diferencial de los genes compartidos entre estos dos serovares. Un ejemplo de regulación diferencial es la ejercida sobre el factor sigma alternativo, RpoS, regulador maestro de la respuesta general a estrés, que contribuye en el ciclo infectivo de estos patógenos. Este factor está regulado a distintos niveles, siendo los mecanismos de proteólisis los más importantes. PhoPQ es un sistema de dos componentes que regula positivamente la acumulación de RpoS en S. Typhimurium. En estrés por bajas concentraciones de Mg2+, PhoP activa la transcripción del gen que codifica a IraP, proteína que impide que RpoS sea degradado por ClpXP. En nuestro laboratorio se ha observado que la acumulación de RpoS es diferente entre S. Typhimurium y S. Typhi, determinándose que la acumulación de RpoS en S. Typhi aumenta en mutantes ΔphoPQ. Como estudios previos se realizó un análisis bioinformático de S. Typhi y S. Typhimurium para intentar explicar estas diferencias y se encontró que nuestra cepa de trabajo S. Typhi STH2370 perdió un segmento genómico en la que estaba incluido el gen iraP. Por lo que nos preguntamos si la falta de iraP en S. Typhi es responsable de las diferencias en la acumulación de RpoS al compararse con S. Typhimurium. En la presente Tesis, se incorporó el gen iraP de S. Typhimurium en S. Typhi STH2370 en una única copia situada en su contexto genético original mediante una técnica de complementación heteróloga en cis y se evaluó su rol en la acumulación de RpoS en la cepa silvestre y en mutantes ΔphoPQ, utilizando fusiones lacZ, Western blot, ensayos de estabilidad de proteínas y ensayos de supervivencia a peróxido de hidrógeno. Además, se realizaron ensayos de invasión y proliferación en células epiteliales HT-29 para determinar si la ausencia de iraP corresponde a un caso de pérdida de función que tiene implicancia en la virulencia de S. Typhi. Encontramos que IraP incrementa la acumulación y la estabilidad de RpoS en condiciones de bajo Mg2+. Por otra parte, la presencia de IraP cambia la regulación de RpoS mediada por PhoPQ. Finalmente se observó que la cepa complementada con iraP presentó una disminución en la capacidad de invasión de células epiteliales HT-29 en comparación con la cepa silvestre. Los resultados obtenidos sugieren que la pérdida de iraP en S. Typhi podría implicar ciertas ventajas evolutivas.Salmonella Typhi (S. Typhi), the causative agent of typhoid fever, exclusively infects humans. Although S. Typhi is closely related to Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium), they differ in host specificity. These differences are due to a multifactorial evolutive process that depends on gain functions, loss functions, and a differential regulation of the genes shared by both serovars. An example of the latter is the regulation of the alternative Sigma factor, RpoS, a master regulator of stress response, that contributes to the infective cycle of these pathogens. This Sigma factor is regulated at different levels, being proteolysis one of the most important regulation mechanisms. PhoPQ is a two components system that positively regulates the accumulation of RpoS in S. Typhimurium. Under low magnesium concentrations, PhoP activates the transcription of IraP, a protein that prevents RpoS degradation by ClpXP. In our laboratory, we observed that RpoS accumulation is different between S. Typhi and S. Typhimurium, and we determined that RpoS accumulation in S. Typhi is increased in ΔphoPQ mutants. Previous bioinformatic analyses of S. Typhi and S. Typhimurium performed to try to explain these differences showed that our reference strain STH2370 lost a genomic segment where iraP was located. Thus, in this work, we incorporated iraP in S. Typhi STH2370 in a single copy and in its original genetic context, using a cis heterologous complementation technique and we evaluated its role in RpoS accumulation in the WT and ΔphoPQ strains, using lacZ fusions, Western blot analyses, protein stability assays and survival in hydrogen peroxide assays. In addition, we performed invasion and proliferation assays in HT-29 epithelial cells, to determine if the absence of iraP corresponds to a case of loss of function implicated in S. Typhi virulence. We found that IraP increases RpoS accumulation in low magnesium concentrations. Also, we found that IraP changes the regulation of RpoS mediated by PhoPQ. Finally, we observed that in an iraP cis complemented strain exhibited a decrease in the ability to invade HT-29 epithelial cells when compared to the WT strain. These results suggest that the loss of iraP in S. Typhi could involve certain evolutive advantages.esSalmonella TyphiEnfermedades InfecciosasInvestigacionesTesis