Fuentes Aravena, JuanRojas Jacob, Diego IgnacioFacultad de Ciencias de la Vida2025-02-282025-02-282023https://repositorio.unab.cl/handle/ria/63626Tesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida)Las vesículas de membrana externa (OMVs) son nanoproteoliposomas que van desde los 20 hasta los 500 nm aproximadamente. Estas OMVs son liberadas desde la membrana externa (OM) de bacterias Gram negativo, lo que no implica lisis celular o muerte de la bacteria. Las OMVs actúan como vehículo de diversos factores al tener la capacidad de internalizarse en la célula hospedera. Por ello, las OMVs pueden ser usadas en aplicaciones biotecnológicas que requieran la entrega de biomoléculas, destacando la importancia de este trabajo. Esta vía de exportación presenta ventajas sobre otros mecanismos secretores, como la protección y/o entrega a distancia del cargamento. La internalización de las OMVs en células eucariontes esta mediada por diferentes rutas de entrada. Actualmente la endocitosis se puede subdividir en macropinocitosis, dependiente de clatrina, dependiente de caveolina, independiente de clatrina e independiente de caveolina. Estas rutas son utilizadas por las OMVs para internalizarse en la célula blanco, siendo el cargamento proteico y el tamaño de las OMVs características importantes para determinar dicha ruta de internalización afectando la cinética de internalización en la célula blanco. Estas características de las OMVs pueden variar dependiendo de las condiciones en la cual crezca la bacteria parental. Estudios realizados en S. Typhimurium demuestran que OMVs extraídas de cultivos crecidos en bajo magnesio poseen un cargamento proteico distinto en comparación a condiciones estándar de laboratorio (Luria Bertani). También, resultados obtenidos en el laboratorio señalan que OMVs obtenidas de condiciones de alta osmolaridad presentan diferencias en el rango de tamaño. Por lo que es plausible sugerir que cambios en la condición de cultivo puede impactar tanto en el cargamento proteico como en el tamaño de las OMVs. S. enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una bacteria Gram negativo causante de la fiebre tifoidea en humanos. En el transcurso de la infección, S. Typhi se enfrenta a distintos microambientes dependiendo de donde se encuentre el patógeno. Al llegar al intestino la bacteria se enfrenta a diversas señales ambientales, donde uno de los más relevantes para este estudio es la alta osmolaridad. Estudios señalan que la alta osmolaridad (300 mM NaCl) aumenta la adherencia de S. Typhi a células epiteliales, lo cual es relevante para su invasión en las células eucariontes. En consiguiente, resultados no publicados obtenidos en el laboratorio demuestran que OMVs extraídas de S. Typhi en condiciones de alta osmolaridad (300 mM NaCl) presentan un perfil proteico distintos a la condición estándar de laboratorio. Lo que podría impactar en la ruta de entrada y la cinética de internalización de las OMVs en la célula hospedera. Por lo tanto, nosotros hipotetizamos en este estudio que las OMVs de S. Typhi presentan una variación en la ruta de entrada y la cinética de internalización en células epiteliales en condiciones de alta osmolaridad. Se compararon OMVs de S. Typhi purificadas en condiciones de baja y alta osmolaridad (0 mM y 300 mM respectivamente). El perfil proteico se estudió por SDS-PAGE y proteómica. El tamaño mediante microscopía de transmisión electrónica (TEM). La determinación de la ruta endocítica mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia y la cinética de internalización por citometría de flujo. Encontramos que cambios en la osmolaridad del ambiente cambia las principales características de las OMVs de interés para nuestro estudio, como el cargamento proteico, la distribución de tamaño y el potencial zeta. Sin embargo, no hubo un cambio en la ruta endocítica de las OMVs extraídas en las distintas condiciones de cultivo ni tampoco en la cinética de internalización. Como conclusión, encontramos que el cambio de la osmolaridad en el ambiente tiene un impacto tanto en el cargamento proteico, tamaño y potencial zeta de las OMVs de S. Typhi, pero esto no afecta ni en su ruta de internalización ni en su cinética de internalización en celulas epiteliales en cultivo.esConcentración OsmolarCélulas EpitelialesSalmonella TyphiTesis