Examinando por Autor "Almonacid, Daniel"

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    Increasing the intracellular isoprenoid pool in Saccharomyces cerevisiae by structural fine-tuning of a bifunctional farnesyl diphosphate synthase
    (2017-06) Rubat, Sebastián; Varas, Ignacio; Sepúlveda, Romina; Almonacid, Daniel; González-Nilo, Fernando; Agosin, Eduardo
    Farnesyl diphosphate synthase (FPPS) is a key enzyme responsible for the supply of isoprenoid precursors for several essential metabolites, including sterols, dolichols and ubiquinone. In Saccharomyces cerevisiae, FPPS catalyzes the sequential condensation of two molecules of isopentenyl diphosphate (IPP) with dimethylallyl diphosphate (DMAPP), producing geranyl diphosphate (GPP) and farnesyl diphosphate (FPP). Critical amino acid residues that determine product chain length were determined by a comparative study of strict GPP synthases versus strict FPPS. In silico ΔΔG, i.e. differential binding energy between a protein and two different ligands-of yeast FPPS mutants was evaluated, and F96, A99 and E165 residues were identified as key determinants for product selectivity. A99X variants were evaluated in vivo, S. cerevisiae strains carrying A99R and A99H variants showed significant differences on GPP concentrations and specific growth rates. The FPPS A99T variant produced unquantifiable amounts of FPP and no effect on GPP production was observed. Strains carrying A99Q, A99Y and A99K FPPS accumulated high amounts of DMAPP-IPP, with a decrease in GPP and FPP. Our results demonstrated the relevance of the first residue before FARM (First Aspartate Rich Motif) over substrate consumption and product specificity of S. cerevisiae FPPS in vivo. The presence of A99H significantly modified product selectivity and appeared to be relevant for GPP synthesis. © FEMS 2017. All rights reserved. For permissions, please e-mail: journals.permissions@oup.com.
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    Microorganismos nativos de la microbiota intestinal como moduladores de condiciones de salud asociadas con el consumo de carbohidratos
    (Universidad Andrés Bello, 2020) Ortiz Ortiz, Rodrigo; Pérez Donoso, José Manuel; Almonacid, Daniel; Facultad de Ciencias de la Vida
    El presente trabajo, tiene por objeto investigar la relación entre microbioma intestinal, consumo de alimentos específicos en la dieta y su impacto en la salud humana de manera de identificar potenciales blancos o moduladores de condiciones de salud presentes en la microbiota intestinal, utilizando la base de datos de microbioma y metadata relacional privada más grande a la fecha de la realización del presente estudio. La identificación de taxas nativos relacionados con la dieta y condiciones de salud, permitirá considerar su utilización a futuro, como blancos de diagnóstico, terapéuticos o directamente como agentes moduladores de dichas condiciones, directa o indirectamente a través de la dieta, permitiendo mejorar la calidad de vida de quienes, por ejemplo, padecen enfermedades crónicas que podrían ser moduladas mediante la dieta, detectar de manera temprana alteraciones metabólicas que puedan estar relacionadas con enfermedades específicas, o bien, permitiría identificar microorganismos nativos de la microbiota intestinal con capacidad de suplementar procesos metabólicos que le permitan al hospedero metabolizar alimentos que no podrían aprovechar sus nutrientes; alternativamente, en el caso de condiciones de salud en las cuales la capacidad de procesamiento de alimentos y absorción de nutrientes se vea deteriorada o comprometida, permitiría intervenir y modular mediante la dieta, el mejoramiento de absorción y metabolización de nutrientes, entendiendo el rol de bacterias claves y nativas en el microbioma intestinal. La aproximación utilizada en la presente investigación, se enfoca en el estudio del microbioma intestinal asociado con el consumo de dietas enriquecidas y restrictivas, respecto del consumo de carbohidratos, incluyendo carbohidratos complejos como lactosa, y condiciones de salud relacionadas, como intolerancia la lactosa, alergia a la lactosa y diabetes tipo 2. Utilizando una base de datos relacional con información del microbioma y hábitos alimenticios del usuario, mediante una aproximación bioinformática, se encontraron microorganismos relacionados significativamente en las condiciones de salud antes mencionadas, y posteriormente, en base a ello se desarrolló un modelo predictivo que permite identificar microorganismos nativos de la microbiota intestinal, como blancos potenciales para modular condiciones de salud, a través de la dieta, y eventualmente otros usos diagnósticos y terapéuticos relacionados. Para explorar el potencial de los microorganismos encontrados y dado que se encontró un microorganismo nativo no secuenciado, se realizó la secuenciación de la cepa tipo de Blautia luti, junto con otras especies del género Blautia estrechamente relacionadas (B. obeum y B. wexlerae). Adicionalmehte, se investigó la capacidad catalítica para degradación de carbohidratos de las especies de Blautia, utilizando redes de similitud de secuencia y la base de datos curada CAZ y, en donde se encontraron nuevas proteínas predichas putativas relacionadas con el Clan GHA, y que podrían tener actividad B-galactosidasa y otras actividades catalíticas específicas, que permitirían degradar diversos tipos de carbohidratos complejos, no digeribles regularmente por el ser humano. Los resultados del presente estudio, sugieren que existirían especies nativas de la microbiota intestinal pertenecientes al género Blautia, capaces de suplementar el metabolismo de lactosa y otros carbohidratos complejos, con potencial biotecnológico como indicador de disbiosis intestinal y/o modulador de condiciones de salud a través de la dieta, y eventualmente como blanco diagnóstico y terapéutico
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    Re-ingeniería de la B-glucuronidasa de E. coli para aumentar su eficiencia catalitica por codeína-6-glucurónido
    (2017) García Mena, Nicole; Almonacid, Daniel; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    El objetivo del proyecto es mejorar la eficiencia catalítica que posee la enzima Pglucuronidasa de Escherichia coli por codefna-6-glucurónido, a fin de reducir el tiempo de hidrólisis de éste metabolito en test de doping (actualmente se logra niveles de hidrólisis deseable en 12 horas). Asumiendo que la eficiencia catalítica de la enzima se correlaciona con la energía de unión del ligando en una confonnación catalftica, lo que se busca en esta tesis es generar mutantes que mejoren la afinidad por codeína-6-glucurónido en una confonnación catalltica similar al primer estado de transición del mecanismo catalftico. A modo comparativo, se partió el análisis utilizando también morfina-3-glucurónido, para la cual se conoce que la enzima tiene una eficiencia cataHtica mayor que por codefna-6-glucurónido. En el Protein Data Bank (PDB) se encuentran 6 cristales de la enzima con diversos rangos de resolución y largos de secuencia. Para identificar el confónnero que mejor sirva de templado para nuestros estudios de unión de ligandos en confonnaciones catalíticas, se tomó cada una de las cadenas presentes en los 6 cristales del PDB y se realizó ensayos de acoplamiento molecular ( docking) de cada uno de las cadenas con ligandos conocidos ( codefna-6-glucurónido y morfina- 3-glucurónido) usando el programa Autodock Vina. El procedimiento anterior arrojó la cadena A de la estructura 3LPF como el mejor confónnero a partir del cual se llevó a cabo un proceso in silico de generación de mutaciones simples y múltiples usando Modeller de fonna automatizada. Para seleccionar los residuos del sitio activo que serían mutados se utilizó el mejor modelo de docking de 3LPF cadena A y morfina-3-glucurónido o codefna-6-glucurónido, y se identificó los residuos aminoacfdicos que estaban en proximidad de los ligandos usando VMD. Con la selección de las mejores mutantes simples, se generaron luego mutantes dobles y triples con criterios específicos de selección. Finalmente, evaluamos si las posiciones mutadas que resultan en mejoras en la unión de codefna-6-glucurónido en confonnaciones catalfticas ocurren en sitios con adaptación positiva (aquellos donde las mutaciones no sinónimas priman por sobre las mutaciones sinónimas) o sitios con adaptación negativa (mutaciones sinónimas predominan por sobre las no sinónimas). Existe evidencia en la literatura para otras familias de enzimas que los sitios con adaptación positiva están involucrados en cambios de especificidad de sustrato, por tanto, mutaciones racionales en sitios con adaptación positiva reflejarían de mejor manera la evolución natural que seguiría esta enzima en un organismo confrontado en la naturaleza con el sustrato de nuestro interés. Para cumplir este objetivo, se identificaron miembros caracterizados de la familia Glicosil Hidrolasa 2 a la que pertenece la P-glucuronidasa de Escherichia coli. A partir de estos se generó una red de similitud de secuencias con el fin de identificar otros miembros de la familia a partir de bases de datos públicas de secuencias. En la red, se identificó un grupo qu{parece ser isofuncional para la actividad P-glucuronidasa que consiste de 3041 secuencias. A partir de estas secuencias se hizo un alineamiento múltiple y considerando todas aquellas secuencias que conservan los residuos catalíticos se detenninó la tasa de mutaciones sinónimas y no sinónimas por codón. La hipótesis de este trabajo postuló que mutantes en sitios con adaptación positiva de la Pglucuronidasa de Escherichia coli mejoran su eficiencia catalítica por codefna-6-glucurónido. Lamentablemente, ninguno de los residuos aminoacfdicos mutados presentó selección positiva. Algunas de las mutantes generadas que fueron caracterizadas por colaboradores en el mesón, a fin de corroborar si cumplen con su objetivo de mejorar la eficiencia catalftica de Ja enzima Pglucuronidasa de E. coli con respecto al ligando codefna-6-glucurónido no observaron aumento de eficiencia con respecto al ligando de interés, lo cual se relaciona con los resultados obtenidos de adaptación negativa obtenidos en el objetivo 3 de la presente tesis.