Examinando por Autor "Barrientos Rios, Victoria"

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    Clonamiento y expresión heteróloga de tres genes que codifican para enzimas del tipo lipasa y proteasa, relacionadas con la actividad nematicida de Pseudomonas veronii R4
    (Universidad Andrés Bello, 2017) Barrientos Rios, Victoria; Prieto, Humberto; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    Pseudomonas veronii R4 es un nuevo aislado bacteriano que ha sido identificado previamente desde un panel de Pseudomonas ssp. fluorescentes con actividad nematicida. En particular, P. veronii R4, presenta actividad nematicida contra el fitopatógeno Xiphinema index, nematodo de importancia comercial en viticultura, debido a que es el principal vector del virus de la hoja en abanico de la vid (GFLV). Tras su caracterización y secuenciación de su genoma, se ha propuesto que esta actividad antagonista sobre X. index se debería a una batería enzimática que consiste en al menos una proteasa (AprA), una lipasa (LipA) y una fosfolipasa (ExoU). Con el objetivo de evaluar y confirmar la actividad nematicida de estas enzimas, en este trabajo de Tesis se clonaron los genes aprA, lipA y exoU (que codifican para las enzimas antes mencionadas) en vectores de entrada y expresión de la serie Gateway, utilizando como hospedero heterólogo la bacteria Escherichia coli BL21(DE3). La sobreexpresión de las proteínas recombinantes en el sistema de expresión produjo agregados de proteínas recombinantes, las cuales se debieron solubilizar y renaturalizar. Ensayos enzimáticos de extractos de enzimas recombinantes, AprA, LipA y ExoU, en los sustratos gelatina, tributirina y sangre, respectivamente, evidenciaron la funcionalidad de estas enzimas. Finalmente, la exposición de X. index frente a los extractos de proteínas enriquecidos con las enzimas AprA (500 μg/mL), LipA (50 μg/mL) y ExoU (50 μg/mL) recombinantes provocaron pérdida de movilidad mayor a 90% después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, evaluado a través de ensayos in vitro. Concordantemente, se observaron, mediante microscopia electrónica de barrido, daños estructurales en la cutícula, deshidratación y exposición de tejidos internos de los nematodos expuestos a los extractos de enzimas recombinantes. Los resultados obtenidos permiten confirmar que la actividad nematicida de la bacteria es causada por al menos las enzimas AprA, LipA y ExoU de R4, lo que además representa proyecciones de estas enzimas para su aplicación biotecnológica.