Examinando por Autor "Bueno R., Susan"

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    Evaluación de la plasticidad genética en Salmonella : estudio de la escisión y pérdida de una isla de patogenicidad inestable (ROD21) en Salmonella enterica serovar Enteritidis
    (Universidad Andrés Bello, 2010) Lizana Vera, Rodrigo Javier; Bueno R., Susan; Riedel S., Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica
    Salmonella enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) es una enterobacteria patógena capaz de causar cuadros de gastroenteritis en humanos y una enfermedad sistémica en ratones. Esta bacteria comparte un 90% de su genoma con otros serovares de Salmonella, mientras que el 10% restante es variable. Algunos de los genes que se encuentran en el 10% de variabilidad fueron posiblemente adquiridos por transferencia lateral de genes y constituyen islas de patogenicidad. Las islas de patogenicidad son un tipo de isla genómica caracterizada por contener agrupados genes que codifican proteínas involucradas en virulencia. Estas regiones se clasifican en islas de patogenicidad estables o inestables, dependiendo de su capacidad de escindirse del cromosoma bacteriano. Las regiones inestables, además de contener genes de virulencia, contienen genes relacionados con movilidad genética, como las integrasas y excisionasas. Además, poseen secuencias directas repetidas que se encuentran en los extremos de la isla de patogenicidad, las que son reconocidas por la proteína integrasa para catalizar su integración ylo escisión. Estas características permiten que la isla de patogenicidad se escinda del cromosoma bacteriano y eventualmente pueda perderse, lo que podría afectar la virulencia de la bacteria durante su ciclo infectivo. Basados en estos antecedentes, se propuso evaluar en esta tesis si el proceso de escisión y pérdida de islas de patogenicidad de Salmonella enterica varía durante el proceso de crecimiento bacteriano, para determinar si corresponde a un proceso dinámico que podría ser modulado durante el ciclo infectivo de la bacteria. Para evaluar este objetivo, se identificaron bioinformáticamente regiones genómicas en S Enteritidis que se encontraban ausentes en el genoma de S. Typhimurium y se evaluó si estas regiones poseían un gen que codifique para una integrasa. Además, se evaluó si estas regiones poseían genes involucrados en virulencia y si se encontraban delimitadas por secuencias directas repetidas. Se identificaron 3 regiones en el genoma de S Enteritidis que cumplían con los parámetros fijados. De estas 3 regiones, se prosiguió el .estudio con la región denominada ROD21, ya que poseía un gen que codifica para un factor de virulencia (tipA) que es requerido por S. Enteritidis para causar infección en ratones. Bioinformáticamente se determinó que ROD21 estaba en una región del cromosoma bacteriano donde hay 3 copias del gen que codifica para un tRNA para asparagina (asnT), uno de los cuales se encuentra en el borde izquierdo de la isla de patogenicidad. En el otro extremo se identificó una secuencia de 22 pb idéntica a la porción 3' de asnT, denominada secuencia directa repetida, lo que permitía deducir que esta región podría-escindirse del cromosoma bacteriano. Utilizando la técnica de PCR anidado se detectó que ROD21 se escinde del cromosoma bacteriano de 2 formas: la primera mediante la recombinación entre el gen que codifica para asnT y el directo repetido, mientras que la segunda forma corresponde a la recombinación entre dos genes que codifican para asnT, que poseen un 100% de identidad entre sí. Utilizando esta técnica también logramos detectar la secuencia que se forma en la isla de patogenicidad cuando se encuentra de forma circular, sin embargo la formación de este elemento episomal sólo pudo ser detectado para la primera forma de escisión. Utilizando una técnica de contraselección basada en la pérdida de los genes que codifican para la bomba de expulsión de tetraciclina, se determinó que la frecuencia con la que sucede el proceso de esción es de 2.42 x 10.8. Sin embargo, esta frecuencia corresponde sólo a la escisión de tipo 2 ya que no se logró obtener bacterias que perdieran ROD21 cuando la escisión ocurre entre las secuencias directas repetidas. Finalmente se diseñó un sistema basado en PCR cuantitativo en tiempo real para calcular la frecuencia de escisión en las diferentes etapas del crecimiento bacteriano. Se determinó que al inicio del crecimiento in vitro existe un aumento en la frecuencia de escisión de ROD21, la que va disminuyendo a medida que aumenta la densidad bacteriana en el medio de cultivo. Los resultados de este trabajo permiten concluir que S. Enteritidis posee islas de patogenicidad inestables en su genoma, cuya frecuencia de escisión varía dependiendo del estado de crecimiento de la bacteria. Esta tesis permitirá sentar las bases para el estudio de islas de patogenicidad inestables en modelos de infección.