Examinando por Autor "Canessa Aguila, Paulo"

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    Análisis transcriptómico dual, de la interacción entre la mutante Δbcfet1 de Botrytis cinerea durante el proceso infectivo de Arabidopsis thaliana, en condiciones contrastantes de hierro
    (Universidad Andrés Bello, 2022) Hinostroza Carmona, Consuelo Paz; Canessa Aguila, Paulo; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    Botrytis cinerea es un reconocido hongo fitopatógeno caracterizado por provocar grandes pérdidas en la agricultura a nivel mundial y por tener un gran número de hospederos. Es un patógeno capaz de colonizar distintos órganos vegetales, produciendo necrosis del tejido con el objetivo de obtener nutrientes a partir de células muertas. En este contexto, los nutrientes disponibles en el encuentro entre B. cinerea y su hospedero modulan el comportamiento de ambos organismos durante la interacción. El hierro, un mineral fundamental para procesos metabólicos y celulares, además de jugar un papel fundamental en la virulencia de los patógenos, tiene también un rol importante en las respuestas de la planta frente a una infección. Investigaciones recientes han demostrado que B. cinerea requiere de un sistema de captación de hierro de alta afinidad denominado RIA (del inglés, Reductive Iron Assimilation), el cual juega un papel en el proceso infectivo. Este sistema se compone de una ferroxidasa de membrana (BcFET1) y una permeasa de hierro BcFTR1. Mediante la generación de una mutante de deleción para la ferroxidasa (Δbcfet1), se evidenció un fenotipo hipervirulento dependiente de la disponibilidad de hierro en la planta, un resultado inesperado debido principalmente a que antecedentes demostraban que la interrupción en componentes de RIA disminuye la virulencia en otros patógenos. Para poder entender más a fondo el comportamiento de la mutante anteriormente mencionada es que, en este trabajo, se realizó un análisis transcripcional mediante RNA-seq dual para evaluar el comportamiento transcripcional de la mutante durante la infección de A. thaliana en condiciones contrastantes de disponibilidad de hierro. Los resultados evidencian que, a pesar de la deleción del gen bcfet1, en ausencia de hierro, la mutante induce genes relacionados al mantenimiento (bcfem1) y absorción transmembrana de este metal (bcftr1), ambos regulados por un mismo factor de transcripción. Al mismo tiempo, A. thaliana presenta un perfil de expresión diferencial asociado a una respuesta de defensa hipersensible, lo que podría estar explicando el mayor daño que se provoca en el tejido vegetal al ser infectado por la mutante de B. cinerea. Si bien este estudio dilucida el comportamiento transcriptómico que ocurre en la interacción entre la mutante Δbcfet1 y A. thaliana, los mecanismos regulatorios y cómo estos se ven afectados por la disponibilidad de hierro, aún no están totalmente claros, por lo cual es de gran interés seguir identificando y caracterizando la regulación de los mecanismos de captación de hierro y cómo estos se relacionan a la virulencia de los patógenos
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    Caracterización del sistema de incorporación de hierro Fet3/Ftr1 en el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea y evaluación de su participación en el proceso de infección
    (Universidad Andrés Bello, 2019) Vásquez Montaño, Esteban Pablo; Canessa Aguila, Paulo; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Biociencias
    Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que infecta un número muy significativo de especies vegetales de interés comercial, afectando principalmente el cultivo de frutilla, uva y tomate, entre otros. Este hongo produce necrosis en los tejidos vegetales que infecta, destruyendo la célula hospedera para obtener los nutrientes, generando cuantiosas pérdidas económicas a nivel mundial. Debido a esto, el estudio de las estrategias de infección de B. cinerea tiene una gran relevancia. Los mecanismos de infección son complejos y variados, y están regulados por distintos factores moleculares y ambientales. Entre las variables ambientales, los micronutrientes juegan un papel fundamental, pero pese a ello, en el caso de B. cinerea, no existe mayor información respecto de cómo distintos micronutrientes pueden incidir en el desarrollo e infección causada por el hongo. En particular, se ha descrito que el hierro es un micronutriente esencial para el desarrollo de la mayoría de los organismos, jugando un papel fundamental en las infecciones de muchos patógenos. Además, está involucrado en las respuestas de plantas frente a estos organismos. En B. cinerea, los mecanismos de captación de hierro no están estudiados, pero la presencia en el genoma de secuencias que codifican para proteínas hipotéticas asociadas a captación de hierro hace pensar que este micronutriente, también estaría jugando un rol fundamental en este organismo. Las proteínas de interés corresponden a Fet3 y Ftr1, caracterizadas inicialmente en Saccharomyces cerevisiae como parte del sistema de captación de hierro de alta afinidad, que también ha sido descrito en hongos fitopatógenos. Fet3 es un ferroxidasa de membrana que permite la oxidación del metal, el que ingresa al intracelular por medio de Ftr1, una permeasa de hierro. Mediante recombinación homóloga en el genoma de B. cinerea, se delecionaron los genes ortólogos a fet3 y ftr1, los que fueron denominaods bcfet3 y bcftr1. De esta forma, se estudió cómo una variable ambiental, hierro, afecta el desarrollo de la infección causada por el hongo en Phaseolus vulgaris y Arabidopsis thaliana. Los resultados muestran que la cepa mutante Δbcfet3 posee un fenotipo de crecimiento/desarrollo atípico en condiciones de ciclos de luz/oscuridad. En comparación con la cepa silvestre, la mutante Δbcfet3 presenta un retraso en el desarrollo de conidias y formación de estructuras de sobrevivencia denominadas esclerocios, las que se generan normalmente condiciones desfavorables. La formación de estas estructuras se revierte de manera dependiente de la concentración de hierro. Adicionalmente, ensayos de virulencia indican que la cepa mutante Δbcfet3 genera lesiones significativamente más grandes, en comparación, con la lesión causada por la cepa B05.10 (silvestre). Contrario a lo que ocurre con la cepa Δbcftr1 donde no se observaron diferencias en el área de lesión. Ensayos cualitativos realizados in planta nos permiten sugerir fuertemente, que la lesión causada por la mutante Δbcfet3 provoca un estallido oxidativo más extenso que el causado por la cepa B05.10 o la mutante Δbcftr1.
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    Determinación de factores moleculares que participan en la generación del fenotipo de infección hipervirulento del hongo Botrytis cinerea mutante para el gen bcfet1
    (Universidad Andrés Bello, 2021) Naranjo Reyes, Jaime Ignacio; Canessa Aguila, Paulo; Facultad de Ciencias de la Vida
    Botrytis cinerea es uno hongo necrotrófico y fitopatógeno que afecta a más de 1000 especies vegetales. Es de vital importancia para el crecimiento y desarrollo de este hongo la concentración y/o disponibilidad de nutrientes. Dentro de estos, el hierro ocupa un lugar de relevancia debido a que participa en casi todos los procesos fisiológicos de un organismo gracias a su capacidad de revertir entre su estado oxidado y reducido. Sin embargo, el metal muestra toxicidad, ya que el Fe(II) puede catalizar la reacción de Fenton, produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS). En los hongos existen principalmente dos mecanismos para captar hierro. El primero a través de sideróforos, una clase heterogénea de moléculas peptídicas pequeñas de síntesis no ribosomal. El segundo sistema consiste en la absorción por agentes reductores que comprende funciones de reductasa y permeasa/ferroxidasa funcionalmente relacionadas y dependientes, el cual se denomina RIA (del inglés, Reductive Iron Assimilation), los que están codificados en el genoma del hongo B. cinerea. Interesantemente, las mutantes simples Δbcfet1 y Δbcftr1 (que forman parte esencial de RIA, codificando para la ferroxidasa y permeasa de hierro, respectivamente) presentan diferencias en su desarrollo e infección. Sólo para el mutante Δbcfet1, se observa un fenotipo de infección hipervirulento, mientras que para el mutante Δbcftr1 no, siendo que se ha descrito en otros sistemas fúngicos homólogos, incluyendo fitopatógenos, una interdependencia funcional entre ambas proteínas. Por esto, para poder comprender de mejor forma el sistema RIA de B. cinerea, e identificar potenciales mecanismos que pudieran explicar la hipervirulencia del mutante Δbcfet1, proponemos en esta tesis generar el mutante doble Δbcfet1+Δbcftr1, comparando su fenotipo de infección con respecto a la cepa silvestre B05.10. Además, mediante análisis bioinformáticos y experimentos de expresión génica, proponemos identificar posibles genes candidatos involucrados en la homeostasis del hierro y evaluar su expresión en diferentes condiciones de disponibilidad del metal, del cual depende la hipervirulencia de la cepa Δbcfet1. Los resultados obtenidos muestran que el fenotipo exhibido por el mutante Δbcfet1+Δbcftr1 es similar al de la cepa mutante Δbcftr1, y no así al de la cepa mutante Δbcfet1. Nuestros análisis nos permitieron identificar 3 posibles genes candidatos que codificarían para la(s) hierroreductasa(s) componente(s) del sistema RIA. En condiciones de inanición de hierro, datos de expresión génica muestran un fuerte aumento en los niveles de expresión del gen bcsidA en la mutante Δbcfet1 pero no así en la cepa silvestre B05.10 del hongo, el que sería el precursor de sideróforos en B. cinerea. Además, según nuestros análisis de expresión, el factor de transcripción hapX de B. cinerea, el que participa de la homeostasis de hierro en otros hongos, también presenta un fuerte aumento en los niveles de expresión en condiciones de limitancia e inanición de hierro y en la mutante Δbcfet1. Los resultados obtenidos sugieren que la sola ausencia del gen bcfet1 no estaría explicando el fenotipo de infección hipervirulento de la mutante Δbcfet1. Por el contrario, en esta mutante, se estaría compensando la deficiencia del sistema RIA, incluso en condiciones de suficiencia de hierro, mediante la síntesis de sideróforos.
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    Obtención de una mutante insercional para el gen Cas9 en el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea para su utilización como herramienta de edición génica implementando el sistema CRISPR/Cas9
    (Universidad Andrés Bello, 2020) López Leiva, Daniela Alexandra Betsabé; Canessa Aguila, Paulo; Facultad de Ciencias de la Vida
    Botrytis cinerea es un hongo patógeno y necrotrófico de plantas de alto interés comercial. Denominado comúnmente como “moho gris”, este produce la pudrición de la parte aérea de las plantas y la podredumbre de vegetales, frutas y flores después de ser cosechados, generando grandes pérdidas económicas en Chile y el mundo. B. cinerea presenta una extraordinaria variabilidad y plasticidad genética, convirtiéndolo en un modelo de estudio clave en la relación planta-patógeno. Actualmente, existe una alta demanda por el desarrollo de técnicas más simples y versátiles en comparación a las disponibles para la manipulación genética de este y otros hongos filamentosos. Por esta razón, el sistema CRISPR/Cas9, Claustered Regularly Interspaced Short Palindromic Reapeats (repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas) es un foco de interés para este hongo y otros organismos patógenos. Este mecanismo inmune de bacterias se ha convertido, en los últimos años, en una potente herramienta de edición de genes, formado por dos componentes, la nucleasa Cas9 y un guía de RNA. Esta ribonucleoproteína actúa como una tijera molecular que permite la introducción de roturas bicatenarias específicas de DNA, facilitando una eficaz selección/edición de genes. En esta tesis, se generó una mutante insercional para el gen Cas9 en el locus del gen Ku70 en B. cinerea. Las mutantes obtenidas fueron genotipificadas mediante PCR. Resultados preliminares muestran un fenotipo de crecimiento similar a la cepa B05.10.
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    Regulación circadiana en la producción de compuestos para defensa contra herbivoría en el alga roja Mazzaella laminarioides (Rhodophyta)
    (Universidad Andrés Bello, 2019) Pérez Lara, Gabriel Abdón; Contreras Porcia, Loretto; Canessa Aguila, Paulo; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Biociencias
    La relación entre herbívoros y organismos autótrofos pareciese estar inclinada a favor de los depredadores. Esto, debido a que son ellos quienes son capaces de seleccionar sus presas y los horarios de alimentación. Estas ventajas están ligadas principalmente por la capacidad de libre movimiento que estos organismos presentan. Sin embargo, el comportamiento reiterado de los herbívoros permite a su vez que los autótrofos sean capaces de anticiparse y defenderse de la presión por herbivoría en el momento que más lo necesiten. Esta capacidad está relacionada a la aparición de maquinaria celular capaz de censar y anticipar los cambios que están vinculados al día a día (como el anochecer y el amanecer), preparándose así a la siguiente ocasión en que estos hechos ocurran. Esta capacidad está regulada por un reloj interno denominado reloj circadiano (del latín “Circa diem”, “aproximadamente un día”), el cual es capaz de regular múltiples procesos de manera simultánea en los organismos, no sólo a nivel individual, sino incluso a nivel de interacciones bióticas. Este tipo de regulación está documentada, para los episodios de herbivoría en la planta vascular modelo de biología vegetal Arabidopsis thaliana y uno de sus depredadores, la oruga de la col (Trichoplusia ni). En este contexto, el reloj circadiano de A. thaliana permite anticipar los episodios de herbivoría de la oruga y, por consiguiente, sintetizar previamente los compuestos que utiliza para sus defensas químicas, sincronizando su defensa con el comportamiento circadiano del insecto. Este tipo de regulación mejora el “fitness” de los individuos de forma considerable, sin embargo, su aparición está ligada principalmente a las oscilaciones predecibles que pueda presentar el ambiente. Este trabajo tiene como objetivo evaluar si la macroalga Mazzaella laminarioides, la cual está expuesta a la presión por herbivoría en el ambiente marino durante horarios principalmente nocturnos, presenta regulación de tipo circadiana en sus defensas. Evaluando inicialmente los patrones alimenticios de uno de sus principales depredadores, Fissurella crassa, realizando experimentos de coincubación con la macroalga a distintas horas del día en ciclos de Luz:Oscuridad y bajo condición de luz constante. Además de evaluar si esto está ligado a cambios a nivel metabólico principalmente relacionados a la producción de metil jasmonato en el alga, un compuesto volátil orgánico ligado principalmente a las funciones de defensa en organismos autótrofos. Los resultados obtenidos reafirman que F. crassa se alimenta de M. laminarioides principalmente durante horarios nocturnos. Además, las diferencias horarias observadas en la interacción de herbivoría entre estos organismos continúa incluso en ausencia de ciclos de Luz:Oscuridad, observándose su persistencia en condiciones de luz constante. Al realizar pruebas de alimentación con el tiempo endógeno de los organismos en antifase (desfasados temporalmente durante 12 hrs), no observamos herbivoría. Al evaluar los niveles de metil jasmonato en la macroalga, se observaron mayores niveles de este compuesto durante el período de tiempo en donde no se observa actividad alimenticia de la lapa, indicando la presencia de otro posible herbívoro. Los resultados revelan un factor endógeno entre la interacción de los organismos aquí evaluados.