Examinando por Autor "Conget, Paulette"

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    La exposición simultánea a dexametasona y rosiglitazona es necesaria y suficiente para generar, a partir de células madre mesenquimáticas, adipocitos funcionales
    (Universidad Andrés Bello, 2012) Contador Martínez, David; Conget, Paulette
    El producto de la adipogénesis es un adipocito funcional, célula que adquiere la maquinaria necesaria para el transporte y síntesis de lípidos, pierde la capacidad de proliferar, tiene alta sensibilidad a insulina y secreta adipoquinas. La etapa mejor caracterizada de la adipogénesis es la maduración, dado que se dispone de líneas celulares comprometidas al linaje adipogénico (3T3-L1 y 3T3-F442A, ambas de ratón). En ellas se han identificado los factores inductores y los mecanismos intracelulares que dan cuentan de la generación de un adipocito funcional. Por el contrario, los eventos moleculares asociados al compromiso de una célula al linaje adipogénico son escasamente conocidos. Las células madre mesenquimáticas (MSCs) representan un atractivo modelo para estudiar las primeras etapas de la adipogénesis, ya que originan, entre otras células, adipocitos. Su multipotencialidad, sus propiedades inmunomoduladoras, y la simpleza con que se aíslan y expanden ex vivo hacen de las MSCs una herramienta ideal para realizar terapia celular. Es así que tanto a nivel pre-clínico como clínico se está evaluando su impacto en diversas patologías. Actualmente, para inducir la diferenciación de las MSCs al linaje adipogénico, las células se exponen a un glucocorticoide (dexametasona), un inhibidor de fosfodiesterasa (isobutil-metil-xantina), un inhibidor de ciclooxigenasa (indometacina) e insulina, combinación que en adelante llamaremos: coctel clásico (CC). Aunque efectivo, dada su complejidad, este estímulo ha dificultado el estudio de los eventos moleculares asociados al proceso de diferenciación adipogénico. Además, a la fecha se desconoce si los adipocitos generados a partir de MSCs expuestas al CC han completado su maduración. En consecuencia, es de interés científico y biotecnológico disponer de un estímulo constituido por menos componentes, cuyo mecanismo de acción sea más fácil de estudiar y que resulte en la generación de adipocitos funcionales. Durante la unidad de investigación desarrollada antes del inicio de esta tesis evaluamos putativos inductores adipogénicos y determinamos que la exposición simultánea a dexametasona y rosiglitazona (D+R) resulta en la generación de adipocitos a partir de MSCs humanas (hMSCs) y de otras especies de mamíferos (ratón, rata, conejo y perro). En la presente tesis hemos avanzado en la caracterización de este inductor de diferenciación adipogénica. Para ello determinamos el estado funcional de los adipocitos generados a partir de hMSCs expuestas a D+R y nos aproximarnos al conocimiento de los mecanismos moleculares asociados a la diferenciación adipogénica inducida por D+R en hMSCs. En el contexto del primer objetivo determinamos el perfil de expresión de los genes propios de adipocitos maduros (RTPCR tiempo real), esto es: i) genes asociados a compromiso adipogénico (CEBP-a y PPAR-Y), ii) genes asociados al almacenamiento lipídico (aP2 y LPL), iii) genes asociados al metabolismo de triacilgliceroles (ACS y PEPCK) y iv) genes de adipoquinas (ADIPONECTINA y LEPTINA). Los resultados obtenidos muestran que todos los genes estudiados se expresan en los adipocitos generados a partir de hMSCs expuestas a D+R. También evaluamos su potencial de proliferación (inmunocitofluorescencia para BrdU y citometría de flujo) y su sensibilidad a insulina (incorporación [H 3]2-DG), encontrando que no proliferan y que responden a bajas concentraciones de insulina. Por último determinamos la capacidad de los adipocitos de secretar adipoquinas (ELISA), demostrando que aquellos generados usando D+R secretan adiponectina y leptina a niveles significativamente mayores que los generados usando CC. En consecuencia, los adipocitos generados a partir de hMSCs expuestas a D+R presentan un claro fenotipo de adipocitos funcionales. Para aproximarnos al mecanismo de acción, primero comprobamos que el blanco canónico de dexametasona, es decir el receptor de glucocorticoides (RG) y él de rosiglitazona, o sea el receptor activado por proliferadores peroxisomales isoforma gamma (PPAR-Y) efectivamente participan en el proceso de diferenciación adipogénico inducido por D+R en las hMSCs. Para ello evaluamos la eficiencia de la generación de adipocitos (microscopia óptica y citometría de flujo) en presencia de un inhibidor de RG (RU486) y/o de un inhibidor de PPAR-Y (GW9662). Los resultados obtenidos muestran que RU486 inhibe totalmente la diferenciación adipogénica mientras que GW9662, lo hace en forma parcial. También observamos inducción de la expresión y translocación desde el citoplasma al núcleo de CEBP-Œ y PPAR-Y, en adipocitos diferenciados con D+R. Finalmente al evaluar la dependencia y la temporalidad de las vías activadas por dexametasona y por rosiglitazona mediadas por C/EBPs y por PPAR-Y , respectivamente; observamos que ellas son interdependientes, y que el tiempo de exposición a dexametasona o rosiglitazona determinan la eficiencia con que ocurre la diferenciación adipogénica de hMSCs inducida por D+R. Considerando todo lo anterior, en la presente tesis se concluye que la activación simultánea de las vías de señalización canónicas de dexametasona y rosiglitazona es necesaria y suficiente para generar, a partir de hMSCs, adipocitos funcionales. Además se muestra que, comparado con CC, D+R presenta ventajas evidentes tanto respecto de su uso como de su comercialización, siendo estas: i) composición más sencilla, ii) promoción de la diferenciación adipogénica de MSCs de diferentes especies de mamíferos, incluso de aquellas refractarias a CC, y iii) generación de adipocitos funcionales, esto es, células que presentan características propias de los adipocitos que se encuentran in vivo.
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    Proregenerative microenvironment triggered by donor mesenchymal stem cells preserves renal function and structure in mice with severe diabetes mellitus
    (Hindawi Limited, 2015) Ezquer, Fernando; Giraud-Billoud, Maximiliano; Carpio, Daniel; Cabezas, Fabian; Conget, Paulette; Ezquer, Marcelo
    The aim of our work was to evaluate, in an animal model of severe diabetes mellitus, the effect of mesenchymal stem cells (MSCs) administration on diabetic nephropathy (DN) progression. After diabetes induction, one group of mice received the vehicle (DM) and other group received a single dose of MSCs (DM + MSCs). DM + MSCs mice showed a significant improvement in functional parameters of the kidney compared with untreated mice. While DM mice presented marked histopathological changes characteristics of advanced stages of DN (fibrosis, glomerulosclerosis, glomerular basement membrane thickening, capillary occlusion, decreased podocyte density, and effacement of foot processes), DM + MSCs mice showed only slight tubular dilatation. The renoprotection was not associated with an improvement in diabetic condition and very low number of donor cells was found in the kidney of DM + MSCs mice, suggesting that renoprotection could be mediated by paracrine effects. Indeed, DM + MSC mice presented increased renal proliferation index, decreased renal apoptotic index and the restoration of proregenerative factors, and anti-inflammatory cytokines levels. Moreover, macrophage infiltration and oxidative stress damage were also reduced in DM + MSCs mice. Our data demonstrate that MSC administration triggers a proregenerative microenvironment in DN kidney, which allows the preservation of the renal function even if diabetes was uncorrected. © 2015 Fernando Ezquer et al.