Examinando por Autor "Holmes, David"
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Ítem Análisis global comparativo en proteomas microbianos extremofílicos(Universidad Andrés Bello, 2013) Duarte Olave, Francisco; Holmes, David; Facultad de Ciencias BiológicasUno de los ejes principales en esta tesis consintió en la comparación de propiedades de las proteínas de microorganismos acidófilos con homólogos de neutrófilos. De cualquier manera, comparaciones adicionales fueron hechas contra alcalófilos. A la fecha, el número de proteínas pertenecientes a microorganismos alcalófilos no es suficiente como para obtener un borrador de conclusiones que puedan ser soportadas estadísticamente. Por otra parte, el enfoque de esta tesis se centró en acidófilos.Ítem Caracterización de la proteína FNR de A. ferroxidans, estructural y funcionalmente.(Universidad Andrés Bello, 2012) Osorio Urtubia, Héctor Marcelo; Holmes, David; Facultad de Ciencias BiológicasRESUMEN: En este estudio se demostró la capacidad de la cepa de A. ferrooxidans ATCC23270 de vivir en condiciones anaeróbicas de crecimiento utilizando S0 y Fe+3 como dador y aceptor de electrones respectivamente. Se identificó en el genoma de la bacteria un gen fnr que podría codificar para el regulador global de la anaerobiosis, la proteína FNR (Fumarate Nitrate Reduction). Al comparar la secuencia aminoacídica de FNRAF, con la del ortólogo mejor caracterizado, la proteína FNR de E. coli, se observó grandes similitudes en relación a los dominios, motivos y aminoácidos importantes para la función de esta clase de proteínas. Entre éstos últimos, se identificó cuatro residuos de cisteína fundamentales para la unión de un centro [4Fe- 4S]+2 en condiciones anaeróbicas en la proteína. Al modelar estructuralmente FNRAF en base a la estructura cristalina de un miembro relacionado de la familia, la proteína CRP (Proteína activadora del catabolismo), se observó una distribución espacial similar de los residuos de cisteína encargados de unir el centro [4Fe-4S]+2, al observado en la proteína FNR de E. coli. Todos estos resultados sugieren fuertemente que FNRAF tiene una función similar al de otras proteínas FNRs descritas en otras bacterias. La proteína FNRAF purificada anaeróbicamente mostró distintas características como color, absorbancia UV-Visible y cantidad de hierro que sugieren fuertemente la unión de un centro [4Fe-4S]+2, el cual es un cofactor esencial para su función regulatoria. Una característica interesante encontrada en FNRAF fue la menor sensibilidad a oxígeno que presentó el centro [4Fe-4S]+2 en comparación a proteínas ortólogas, lo cual no ha sido descrito anteriormente en otras bacterias y podría dar cuenta del funcionamiento de la proteína tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas de crecimiento, permitiendo de este modo, una mejor transición de la bacteria entre ambos tipos de ambientes. También se logro identificar en la bacteria distintos sitios de unión de FNRAF ubicados en regiones promotoras de genes pertenecientes a distintas vías metabólicas tales como transporte de membrana, stress, reacciones redox, regulación transcripcional y metabolismo energético. En esta última categoría se identificó un complejo multienzimático de proteínas de membrana denominado SreABCD, el cual ha sido asociado en otros microorganismos a la reducción anaeróbica de azufre. Ensayos de RT-qPCR y proteómica demostraron que tanto a nivel transcripcional como traduccional, los niveles de expresión de sreABCD se vieron incrementados en fase estacionaria del crecimiento anaeróbico. Análisis de co-transcripción mediante RT-PCR demostraron que sreABCD se expresó como una sola unidad transcripcional constituyendo por ende un operón. La ubicación de este sitio de unión a FNR es característico de promotores tipo II (sitio de unión de FNR ubicado rio arriba de caja -35 de unión a la RNA polimerasa), los cuales...Ítem Estudio bioinformático de elementos móviles de DNA en Procariontes(Universidad Andrés Bello, 2011) Riadi Mahías, Gonzalo; Holmes, DavidLas Transposasas (Tnps) son enzimas codificadas por las Secuencias de Inserción (ISs ). Tnps son una de las proteínas más comunes encontradas en la naturaleza y juegan un rol importante en la evolución de los genomas. Entretanto, son difíciles de predecir bioinformáticamente y dada la creciente disponibilidad de genomas y metagenomas procariontes, es esencial desarrollar una anotación automática de Tnps rápida y de buena calidad. Adicionalmente, una base de datos de Tnps cuidadosamente anotada podría potencialmente revelar nuevos conocimientos biológicos. Esta tesis: (i) describe métodos para una predicción y clasificación mejorada de Tnps; (ii) genera un servicio web (http://www.mobilomics.cl) basado en estos perfeccionamientos de manera que biólogos puedan anotar nuevos genomas y secuencias de genes; (iii) describe la construcción de una base de datos que alberga más de 1.150 genomas pre anotados en su contenido de Tnps y (iv) describe nuevos conocimientos biológicos revelados por un análisis multidimensional de más de 210.000 Tnps. Un nuevo método es descrito para el descubrimiento de Tnps, basado en la generación y uso de Perfiles de Cadenas de Markov Escondidas (HMM), construidos usando Tnps conocidas depositadas en la base de datos pública ISFinder. Como parte de esta tesis, ISFinder fue, en primer lugar, curada, de manera a remover sus errores de anotación. Los Perfiles HMM de secuencia fueron luego usados para predecir cerca de 210.000 Tnps en 1.150 genomas procariontes incluyendo cerca de 7.000 nuevas Tnps. El análisis multidimensional de las Tnps reveló: (i) la tendencia general de un genoma a que la integración de ISs esté centrada alrededor del punto de terminación de la replicación del DNA en genomas circulares; (ii) muchos genomas contuvieron una plétora de familias de Tnps pero, a excepción de unas pocas parejas de familias, no hubo correlaciones positivas ni negativas con respecto a la caocurrencia de familias de Tnps dentro de un genoma particular; (iii) no se detectó correlación significativa entre cantidad de Tnps de una familia particular y variables genómicas, incluyendo %G+C del genoma, tamaño de genoma y el número de familias de Tnps presente en los genomas; (iv) ciertas familias de Tnps se mostraron más abundantes en nichos ecológicos específicos (por ejemplo, pH bajo); (v) ciertas familias de Tnps se mostraron más prevalentes en grupos taxonómicos específicos; (vi) las familias de Tnps extendidas mostraron discrepancias que sugieren que hay cerca de 14.000 secuencias de proteínas en la base de datos Protein de NCBI cuya anotación podría ser mejorada.Ítem Generation and analysis of expressed sequence tags from Botrytis cinerea(Sociedad de Biología de Chile, 2006) Silva, Evelyn; Valdez, Jorge; Holmes, David; Shmaryahu, Amir; Valenzuela, PabloBotrytis cinerea is a filamentous plant pathogen of a wide range of plant species, and its infection may cause enormous damage both during plant growth and in the post-harvest phase. We have constructed a cDNA library from an isolate of B. cinerea and have sequenced 11,482 expressed sequence tags that were assembled into 1,003 contigs sequences and 3,032 singletons. Approximately 81% of the unigenes showed significant similarity to genes coding for proteins with known functions: more than 50% of the sequences code for genes involved in cellular metabolism, 12% for transport of metabolites, and approximately 10% for cellular organization. Other functional categories include responses to biotic and abiotic stimuli, cell communication, cell homeostasis, and cell development. We carried out pair-wise comparisons with fungal databases to determine the B. cinerea unisequence set with relevant similarity to genes in other fungal pathogenic counterparts. Among the 4,035 non-redundant B. cinerea unigenes, 1,338 (23%) have significant homology with Fusarium verticillioides unigenes. Similar values were obtained for Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus nidulans (22% and 24%, respectively). The lower percentages of homology were with Magnaporthe grisae and Neurospora crassa (13% and 19%, respectively). Several genes involved in putative and known fungal virulence and general pathogenicity were identified. The results provide important information for future research on this fungal pathogen.Ítem Predicción bioinformática y validación experimental de genes RNA regulatorios pequeños en la bactería extremófila Acidithiobacillus ferrooxidans(Universidad Andrés Bello, 2010) Shmaryahu, Amir; Holmes, David; Facultad de Ciencias Biológicas; Doctorado en BiotecnologíaRESUMEN: En bacterias los RNA reguladores pequeños (srRNA – “small regulatory RNA”) controlan la expresión génica, usualmente a nivel post-transcripcional. Esto lo hacen actuando como RNAs anti-sentido uniéndose al transcrito (mRNA) de los genes blanco (mRNAs) o interactuando con las proteínas reguladoras. Los srRNAs están involucrados en la regulación de una amplia variedad de procesos, tales como la replicación de plasmidios, el transporte, la replicación viral, la virulencia bacteriana y algunos de los circuitos genéticos globales que responden a cambios ambientales. Desde su descubrimiento, hace unos pocos años, se ha comprobado que se encuentran presentes en una variedad de organismos distintos. Sin embargo, su detección/predicción utilizando herramientas bioinformática es particularmente desafiante dado que no codifican para proteínas, son poco conservados a nivel nucleotídico y sólo algunos exhiben estructura secundaria conservada. En este trabajo utilizamos herramientas computacionales para predecir los srRNAs en la secuencia genómica de la bacteria extremófila Acidithiobacillus ferrooxidans, uno de los microorganismos más utilizados en la recuperación biológica de metales a partir de minerales azufrados, y herramientas de biología molecular para validarlos. La estrategia empleada involucra en primer lugar un análisis de genómica comparativa utilizando los genomas de Acidithiobacillus caldus y Acidithiobacillus thiooxidans (secuenciados por Fundación Ciencia para la Vida [88]) para identificar candidatos de srRNA conservados en las regiones intergénicas en bacterias cercanas filogenéticamente. Las regiones intergénicas conservadas fueron extraídas del genoma de A. ferrooxidans e investigadas para determinar cuáles de las secuencias son complementarias a genes que codifican proteínas y se asocian a promotores sigma 70 predichos. En segundo término, se estudió la expresión de los candidatos srRNAs por Northern blot y “RACE”. Como producto de este análisis se derivaron 11 nuevos srRNA en A. ferrooxidans. Adicionalmente, se ha desarrollado un nuevo programa para identificar posibles RNAs blancos de srRNA. Este programa, llamado “Kissing Complex”, se enfoca en la X búsqueda de conexiones anti-sentido entre srRNAs y mRNAs (RNAs blancos) en la región simple hebra, específicamente, donde el RNA forma lazos o “loops”. La identificación de los srRNAs potenciales entrega información relevante y novedosa en relación a la regulación de la expresión génica en A. ferrooxidans, permitiendo ampliar las áreas de investigación abordadas hasta la fecha y abriendo nuevas ventanas en los estudios biológicos de este microorganismo, contribuyendo así a nuestra comprensión del inusual metabolismo de las bacterias acidófilas y, eventualmente, a nuestro entendimiento de la biolixiviación.Ítem Regulación de los niveles intracelulares del represor transcripcional Fur de Acidithiobacillus ferrooxidans(Universidad Andrés Bello, 2011) Lefimil Puente, Claudia Andrea; Holmes, David; Jedlicki, EugeniaEl hierro es un nutriente esencial para todos los organismos, pero en exceso conduce a daño macromolecular vía estrés oxidativo (reacción de Fenton). El regulador transcripcional Fur (Ferric Uptake Regulator) ha sido mostrado de ser el responsable en coordinar los procesos fisiológicos involucrados en la captación, incorporación y almacenamiento (homeostasis) de hierro en todas las bacterias Gram negativas estudiadas a la fecha. At. ferrooxidans, una bacteria Gram negativa, es un interesante e inusual modelo para estudiar la homeostasis de hierro debido a que vive a pH 2 donde la biodisponibilidad de hierro es muy alta, y porque además necesita balancear el uso de hierro como un micronutriente versus su uso como fuente de energía. En muchos organismos estudiados, Fur ha sido encontrado en elevados niveles intracelulares pero muy poco es conocido sobre los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de su expresión. En esta tesis, se observó que los niveles de Fur en At. ferrooxidans varían dependiendo de la fase de crecimiento en que se encuentre la bacteria, incrementándose en fase logarítmica tardía. Sin embargo, estos cambios no fueron debidos a variaciones en los niveles de mRNA de Fur AF, que permanecen constantes. También se determinó que ambos, el mRNA y la proteína FurAF, varían en respuesta a cambios en el sustrato energético tilizado en el medio de cultivo, sugiriendo la posibilidad de que estas variaciones se deban a regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional. Predicciones bioinformáticas de sitios de unión a factores de transcripción en la región promotora de furAF, o cercana a ésta, junto a los ensayos in vivo de expresión de genes en el sistema heterólogo de E. coli son consistentes con la idea de que furAF puede ser transcrito por la RNA polimerasa asociada a diferentes factores sigma, incluyendo sigma70, sigma32 y sigma54. Predicciones bioinformáticas también sugieren que la transcripciónde furAF podría ser regulada por el activador CRP (CAP) indicando un potencial nexo entre el metabolismo del carbono y la homeostasis de hierro. El análisis de estabilidad del mRNA de furAF mostraron que éste posee una elevada vida media de 0,5-4 horas (comparada con 1-20 minutos para un típico mRNA), y que su vida media varía dependiendo del medio de cultivo en que At. ferrooxidans es crecido. Además, se detectó un RNA, denominado frr, que es transcrito de manera antisentido a fur. Análisis de su transcripción, incluyendo su sitio promotor y terminador, acoplado con una predicción de su estructura secundaria sugieren un modelo en que Frr puede unir el mRNA de FurAF promoviendo el acceso del ribosoma e incrementando los niveles de FurAF· Este es un nuevo mecanismo para la regulación post-transcripcional de Fur.