Examinando por Autor "Morales Sierra, Eduardo Hugo"

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    Caracterización bioquímica y funcional del sistema de dos componentes ArcAB de Salmonella enterica serovar Typhimurium en respuesta a condiciones de estrés oxidativo
    (Universidad Andrés Bello, 2013) Morales Sierra, Eduardo Hugo; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas
    Salmonella enterica serovar Typhimurium es una bacteria Gram-negativo, anaerobio facultativo y patógeno intracelular que genera fiebre entérica en el modelo murino. Una vez ingerida por vía oral atraviesa el intestino y es intemalizada por las células fagocíticas. En este lugar, es contenida en un ragosoma especializado denominado "vacuola contenedora de Salmonella", donde se encuentra con una serie de compuestos antimicrobianos incluyendo las especies reactivas de oxígeno (ROS). Para sobrevivir, la bacteria ha generado diversos mecanismos de defensa que incluyen modulación de la producción de ROS, su degradación directa y cambios en la permeabilidad de su membrana externa En este contexto, la expresión de diversos genes que codifican porinas se ve alterada en respuesta a ROS y adicionalmente presentan diversos sitios de unión para el regulador global ArcA. Esto nos llevó a la hipótesis de que "El sistema de dos componentes ArcAB detecta y responde a estres oxidativo en Salmonella enterica serovar Typhimurium y produce cambios en la expresión génica para su supervivencia". Mediante la medición de los niveles de transcrito de los genes ompD, ompW, ompSJ y ompS2 y ensayos de cambio en la movilidad electroforética se demostró que el sistema de dos componentes ArcAB modulaba su expresión de manera directa en respuesta a ROS. Una vez demostrado que el sistema participaba regulando la expresión génica en estas condiciones, se evaluaron cambios transcripcionales globales mediante hibridación en microarreglos. El análisis reveló que ArcA regula 58 genes en respuesta a H2O2 mientras ArcB 68 y que la regulación de cada miembro del sistema es independiente entre si ArcA regula la expresión de genes implicados en metabolismo central, síntesis de siderófoms, glutatión y nucleótidos. Por su parte, el rol de ArcB se asocia principalmente con 1a regulación de la expresión de genes implicados en la biosíntesis de aminoácidos. Análisis bioquímicos revelaron que AICA es requerido _para mantener un balance en los niveles de NADH, el pool de glutatión y los niveles de ROS intracelulares. Finalmente, la medición de los niveles · de transcrito de arcA y arcB y de sus productos génicos, además del uso de mutantes puntuales de ]a proteína AICA y AICB en los residuos implicados en la transferencia del grupo fosfato permitieron identificar los residuos necesarios para mediar· la resistencia a H2O2 por cada uno de los miembros del sistema.
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    Construcción de cepas auxótrofas de levaduras vínicas silvestres para mejoramiento genético
    (Universidad Andrés Bello, 2009) Morales Sierra, Eduardo Hugo; Saavedra Sánchez, Claudia; Facultad de Ciencias de la Salud; Escuela de Bioquímica
    Las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae son las principales responsables de llevar a cabo el proceso de fermentación vínica. Dentro de las diferentes cepas de S. cerevisiae involucradas en el proceso, existen características que son importantes desde el punto de vista enológico, como una eficiente asimilación de nitrógeno y consumo de azúcar, una baja cantidad de azúcar residual finalizada la fermentación, así como una alta producción de glicerol. Sin embargo, estas características no se encuentran naturalmente en una sola cepa. Para solucionar esta problemática, se hace uso de diferentes herramientas que permiten obtener una cepa con dos o más características importantes para el proceso de fermentación alcohólica. La estrategia más utilizada consiste en la generación de mutantes auxótrofas a partir de las cepas que posean las características de interés. De esta forma, se pueden realizar cruces entre las cepas con el objetivo de generar híbridos, los cuales deben ser evaluados para determinar si la cepa resultante posee las dos o más características que poseen sus cepas parentales. Es de vital importancia obtener marcadores para poder determinar de manera rápida y fácil aquellas cepas que son híbridos, debido que una condición que poseen las cepas nativas es ser homotálicas, y por lo tanto tienen la capacidad de autodiploidizarse. En esta tesis se utilizaron cassettes de disrupción génica generados por PCR para construir cepas auxótrofas de S. cerevisiae que habían sido seleccionadas previamente por poseer características favorables para el proceso de fermentación. De esta forma, al generar las cepas auxótrofas, éstas podrían ser utilizadas en un programa de mejoramiento genético. VII Para realizarlo, se utilizó el sistema cre-loxP-kanmx. Los genes interrumpidos fueron los genes ura3 y trp l. Se logró reemplazar ambos alelos del gen trpl en el locus TRP 1, lo cual fue confirmado a nivel genotípico mediante PCR. A estas cepas se les evaluó la tasa de crecimiento, su velocidad máxima de crecimiento y su capacidad de esporulación. Los resultados obtenidos indican que la interrupción de ambos alelos afecta significativamente la tasa de crecimiento, la velocidad máxima de crecimiento y la capacidad de esporulación de las cepas generadas. Por su parte, la confirmación fenotípica de los eventos de disrupción mostró que las diferentes cepas eran capaces de crecer en medio mínimo, lo cual indica que no se logró generar una auxotrofía para triptófano. Estos datos sugieren que las cepas en estudio poseen copias adicionales del gen trpl en otras ubicaciones del genoma, lo cual debe ser evaluado.