Examinando por Autor "Rodas Garrido, Paula"
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Ítem Análisis de la expresión de los genes codificantes para las moléculas MIP3α y SLPI en células epiteliales de trompa de Falopio humana infectadas con Neisseria gonorrhoeae(Universidad Andrés Bello, 2017) Argandoña Cordero, Michel; Salas Cordero, Gabriela; Sepúlveda Silva, Nicolás; Rodas Garrido, Paula; Facultad de Medicina; Escuela de Tecnología MédicaLa gonorrea es una infección de transmisión sexual (ITS) causada por el agente patógeno Neisseria gonorrhoeae, que corresponde a un microorganismo bacteriano con morfología cocoide estructuralmente caracterizado por su disposición en diplococo y con afinidad tintorial Gram-negativo. Se considera un patógeno humano exclusivo y dentro de sus factores de virulencia destaca la presencia de Pili, que le proporciona alta capacidad de fijación a mucosas. La presentación clínica de esta ITS en mujeres es principalmente asintomática, pero puede llegar a generar graves secuelas cuando logra ascender hacia la mucosa epitelial de las trompas de Falopio, ya que puede desencadenar enfermedad inflamatoria pélvica, embarazo ectópico e incluso producir infertilidad. Si bien en la infección con gonococo se ha estudiado ampliamente la secreción de algunas citoquinas proinflamatorias por parte de tejido infectado con reclutamiento masivo de macrófagos y neutrófilos a la zona de infección, se desconoce si hay participación de factores moleculares involucrados en el reclutamiento de células de la inmunidad innata, tales como la molécula secretora de leucocitos inhibidores de proteasas (SLPI), cuya función es proteger a la mucosa de la enzima elastasa liberada desde los gránulos primarios o azurófilos de los neutrófilos y la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP3α), con función en el reclutamiento de linfocitos y neutrófilos. Por lo tanto, el objetivo de esta unidad de investigación fue evaluar los niveles de expresión de los genes codificantes para estas tres moléculas. La metodología para evaluar la expresión de estos genes fue mediante el análisis de transcripción reversa y PCR cuantitativo (RT-qPCR) desde RNAm total de células epiteliales de trompas de Falopio humanas infectadas con Neisseria gonorrhoeae a distintos tiempos (4, 8, y 24 horas). El control de la expresión de genes se realizó mediante la detección de la expresión del gen ribosomal 18S, y como control de la infección se utilizó la medición de la expresión de los mismos genes en células que no han sido infectadas. Nuestros resultados mostraron que para el gen MIP3α a las concentraciones de RNA total empleadas en este estudio no es posible obtener resultados que demuestren que exista un aumento en la concentración de este ante la infección por Neisseria gonorrhoeae, mientras que para el gen SLPI si bien se logran obtener resultados que demuestran un aumento en la expresión del gen en estado de infección, no se puede asegurar que este pertenezca SLPI ya que se detectó la presencia de lo que podría ser posible contaminación o dímeros de primers. Se concluye que para MIP3α es necesario aumentar la concentración de RNA total utilizadas por sobre 4000 pg y sobre los 40 ciclos de PCR esto en base al ensayo realizado en este estudio, con el fin de poder responder si existe un aumento de MIP3α durante la infección por gonococo. Para el gen SLPI si bien existe un aumento de concentración se deben tomar todas las precauciones necesarias para evitar contaminaciones las cuales interfieren y de esta forma poder comprobar si el aumento de concentración se debe efectivamente a el gen SLPI.Ítem Análisis de la expresión de los genes de las citoquinas IL-1β e IL-18 en cultivo primario de células epiteliales de trompa de falopio humana infectadas con neisseria gonorrhoeae(Universidad Andrés Bello, 2018) Abarca Inostroza, Aracely Odalis; Espinoza Martinez, Ruth Carolina; Rodas Garrido, Paula; Facultad de Medicina; Escuela de Tecnología MédicaNeisseria gonorrhoeae es el agente causal de la gonorrea, una infección de transmisión sexual (ITS) que en mujeres generalmente es asintomática, por lo que puede derivar en diversas complicaciones e incluso infertilidad cuando la bacteria coloniza el epitelio de las trompas de Falopio. Esto se debería a la secreción de mediadores inflamatorios como las citoquinas IL-1β e IL-18, que en conjunto: estimulan la secreción de otras citoquinas proinflamatorias, reclutan linfocitos T citotóxicos, neutrófilos y células natural killer (NK) al sitio de infección, activan moléculas de adhesión endotelial, entre otras actividades microbicidas protectoras contra agentes infecciosos. Esta amplia respuesta debe estar en equilibrio para efectuar la máxima capacidad microbicida con el menor daño posible hacia el tejido, sin embargo, la presencia de gonococo en la mucosa tubaria, estimula un reclutamiento masivo de componentes inflamatorios, agravando el daño con una excesiva inflamación no controlada que conlleva a infertilidad debido a los mecanismos de reparación del tejido afectado. A diferencia de la vía del TNF-alfa, aquellas vías relacionadas a IL-1β e IL-18 en la respuesta inflamatoria gatillada por gonococo no han sido estudiadas en profundidad, por lo cual en este trabajo se realizó un análisis de expresión génica para estas citoquinas a través de transcripción reversa y PCR en tiempo real (RT-qPCR) con muestras de RNA mensajero extraído de células epiteliales de trompa de Falopio humana infectadas con N. gonorrhoeae a distintos tiempos de infección. Mediante la normalización de los resultados de cada gen de interés con el gen control de expresión ribosomal 18S se esperaba presenciar un aumento significativo de estas citoquinas en infección por gonococo, sin embargo, los niveles de expresión hallados en IL-18 refutan el motivo de la investigación al disminuir en función del tiempo transcurrido; esto aportaría información relevante para su posible proyección hacia tratamientos médicos alternativos a antibióticos.Ítem Evaluación de la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes libre de células enriquecidos en proteínas producidos por Lactobacillus Acidophilus, L. Casei, L. Fermentum y L. Rhamnosus, sobre el patógeno humano Neisseria Gonorrhoeae(Universidad Andrés Bello, 2018) Simonetti Covarrubias, Gigliola; Rodas Garrido, Paula; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaLactobacillus spp. es un microorganismo perteneciente a la microbiota normal tanto del tracto digestivo como del tracto vaginal del ser humano. Es el microorganismo predominante presente en la microbiota normal del tracto vaginal, responsable de mantener la salud urogenital mediante la prevención del crecimiento o invasión de patógenos, a través de su adhesión al epitelio de la zona genital vaginal y además por secretar al medio extracelular compuestos antimicrobianos como ácido láctico, peróxido de hidrogeno, ácido acético y bacteriocinas. Éstas últimas proteínas de bajo peso molecular que son las de interés en este trabajo. Uno de los patógenos de interés en salud sexual es Neisseria gonorrhoeae, el cual es el agente causante de la gonorrea. Este microorganismo adquiere con facilidad resistencia a las terapias antimicrobianas, por ello que actualmente existe resistencia de las cepas a las cefalosporinas de tercera generación que corresponden al último antimicrobiano para tratar la enfermedad. Por lo tanto, es necesario buscar nuevas alternativas a las terapias de antibióticos convencionales Actualmente existe escasa evidencia en cuanto al efecto de las bacteriocinas de Lactobacillus spp. frente a Neisseria gonorrhoeae. En consecuencia, el principal objetivo de este trabajo es evaluar las propiedades bactericidas de los sobrenadantes libre de células enriquecidos en proteínas de bajo peso molecular, producidos por Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. fermentum y L. rhamnosus contra el patógeno humano Neisseria gonorrhoeae. Para ello se precipitaron los sobrenadantes libre de células (CFS) de los distintos Lactobacillus en estudio y se determinó la presencia y tamaño de las proteínas de interés mediante electroforesis, utilizando geles en gradiente de tricina 16%/6M urea. En cuanto a las proteínas observadas en la electroforesis se vieron bandas entre 6 y 14 kDa, 17 y 28 kDa y > 30 kDa, sugiriendo la presencia de bacteriocinas en los CFS utilizados en este estudio. Debido a que la producción de estos péptidos es dependiente del pH y temperatura, posteriormente se evaluó cómo estos dos factores ambientales afectaron la producción de las proteínas y el efecto antimicrobiano del CFS cuando se modificaron las dos variables antes mencionadas. Además, se evalúo la actividad bactericida de cada CFS sobre un césped del patógeno N. gonorrhoeae en placas GC para demostrar su efecto antimicrobiano. También, se evaluó el potencial efecto sinérgico entre los CFS de los distintos Lactobacillus sobre el patógeno de interés. Nuestros resultados mostraron que efectivamente hay un cambio en el efecto bactericida de los CFS cuando se modifican las variables de pH y temperatura, obteniéndose un efecto bactericida mayor en tiempos tempranos, al inicio de la fase exponencial cuando se expone a la bacteria Lactobacillus a un medio de cultivo de pH 6,5 inicial a diferencia de lo que ocurre en condiciones similares a las fisiológicas en cuanto a la temperatura 37 °C y pH 5,5 donde el mayor efecto bactericida se obtuvo en tiempos tardíos correspondientes a las 48 h (término de la fase estacionaria). Finalmente, en dos de las especies se observó que a 30°C el mayor efecto antimicrobiano se observó en fase exponencial, a diferencia de 37 °C que fue observado en fase estacionaria. En conclusión, nuestros resultados indican que las cuatro especies de Lactobacillus en estudio presentan en el sobrenadante libre de células compuestos proteicos secretados al medio extracelular con acción antimicrobiana frente al pátogeno N. gonorrhoeae. Además la modificación del pH y la temperatura genera un cambio en la actividad antimicrobiana de la fracción proteica de los CFS. Esto nos da una primera visión para seguir investigando y poder desarrollar un sistema de prevención y cuidado de la zona genital femenina, en la adquisición de infecciones bacterianas de transmisión sexual.Ítem Evaluación de la expresión de la enzima ADP-ribosiltransferasa NarE durante la invasión de epitelio de trompa de Falopio humana con Neisseria gonorrhoeae(Universidad Andrés Bello, 2018) Alamos Musre, Alfredo Said; Rodas Garrido, Paula; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaNeisseria gonorrhoeae (gonococo) es una bacteria Gram-negativo, patógeno exclusivo del ser humano y agente etiológico de la infección de transmisión sexual gonorrea. La incidencia de esta infección en la población ha ido en aumento desde el año 2009 y si bien la infección posee tratamiento, la multirresistencia a antimicrobianos que posee gonococo y las secuelas crónicas que puede dejar en la mujer son de gran importancia, esto debido a que si la infección asciende hasta las trompas de Falopio existe el riesgo de infertilidad. Se ha reportado que N. gonorrhoeae es capaz de invadir las células del epitelio tubárico mediante el reordenamiento del citoesqueleto, sin embargo, se desconocen las bases moleculares de esta remodelación. En nuestro laboratorio se demostró que gonococo posee el gen narE previamente identificado en Neisseria meningitidis, el cual codifica para la toxina NarE, una ADP-ribosiltransferasa. Se ha reportado que en otros patógenos bacterianos estas toxinas participan en la invasión mediante la modificación de proteínas del citoesqueleto de la célula blanco por una ADP-ribosilación. El principal objetivo de esta Tesis es evaluar la expresión del gen narE de Neisseria gonorrhoeae y detectar la presencia de la enzima durante la infección de células epiteliales de trompas de Falopio humana. Para ello se realizó una extracción de ARN bacteriano antes de infectar cultivos primarios y luego a distintos tiempos posteriores a la infección (4, 8, 12 y 24 horas) y se evaluó la expresión del gen narE mediante RT-qPCR. Posteriormente se realizó una fusión génica de narE con el epítope 3xFLAG para la detección de NarE-3xFLAG mediante Western blot en las condiciones antes descritas. Nuestros resultados mostraron que en N. gonorrhoeae hubo una expresión constitutiva del gen narE y que cuando el patógeno se encontró en contacto con células epiteliales de trompa de Falopio humana la expresión del gen narE aumentó durante las primeras horas de la infección (4 horas post-infección), mientras que la expresión disminuyó en los últimos tiempos de infección (12 y 24 horas post-infección). Además, se detectó la enzima en la fracción periplasmática de la bacteria. Posteriormente la proteína NarE fue detectada en los tiempos de 4, 8, 12 y 24 horas post infección. Adicionalmente se detectó que NarE apareció en una fracción de proteínas asociadas al citoesqueleto (E-cadherina, β-tubulina). Estos resultados sugieren que la enzima NarE de Neisseria gonorrhoeae participa en la modificación del citoesqueleto de células epiteliales de trompas de Falopio humana y que este efecto es importante en las primeras horas de infección. Por ello, es probable que NarE sea parte de los mecanismos moleculares utilizados por la bacteria durante el proceso de invasión de células epiteliales de trompas de Falopio humanas.