Examinando por Autor "Salinas Aravena, Kazherine Gloria"

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    Evaluación in vitro de la interacción del receptor de Vitamina D3 con Proteínas Sumo
    (Universidad Andrés Bello, 2016) Salinas Aravena, Kazherine Gloria; Montecino Leonard, Martín; Facultad de Ecología y Recursos Naturales
    La acción de Vitamina D3 está relacionada principalmente con la modulación transcripcional mediante la interacción con el receptor de la Vitamina D3 (VDR). VDR se ha asociado a diferentes vías de regulación de los procesos de desarrollo, reproductivos, metabólicos e inflamatorios. Existen evidencias de que VDR recluta diferentes complejos correguladores, generando diferentes respuestas en la regulación transcripcional de un mismo gen. En la actualidad, el mecanismo de cómo ocurre el reclutamiento de estos correguladores aún es desconocido. Se consideró la posibilidad de que VDR interactúe con correguladores que poseen modificaciones postraduccionales como proteínas SUMO (small ubiquitin-like modifier). Estudios preliminares realizados en el Centro de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Andrés Bello permitieron definir que VDR poseería motivos de interacción a SUMO (SIM, por Sumo interaction motif) en el dominio de unión a ligando (LBD) y se demostró la interacción entre VDR y SUMO-1 in vitro. Por lo tanto, la SUMOilación de correguladores podría estar posibilitando su interacción con VDR. Por lo anterior, en esta Tesis se determinó si las proteínas SUMO se unen a VDR mediante los motivos de interacción SUMO (SIM) descritos bioinformáticamente. Como principal objetivo, se evaluó la interacción del receptor de Vitamina D3 (VDR) y las proteínas SUMO-2 y SUMO-3 durante la respuesta a Vitamina D3. Se demostró esta interacción, mediante la generación de proteínas recombinantes de SUMO-2 y SUMO-3 con GST, el cual se obtuvo a través del subclonamiento de la secuencia de estos genes en el vector pGEX5X3, y posteriormente se realizó la sobreexpresión y purificación de GST-SUM02 y GST-SUM03 por incubación con la resina glutatión-sefarosa 4B. Finalmente. Se efectuaron ensayos de interacción proteína-proteína de VDR con GST-SUM02 y GST-SUM03 mediante GST-pulldown. Como segundo objetivo, se definieron cuáles son los motivos SIM involucrados en la interacción entre VDR y las proteínas SUMO-1, SUMO-2 y SUMO-3 durante la respuesta a Vitamina D3 in vitro. Se realizaron mutaciones sitio-dirigidas en tres motivos SIM, luego se hicieron transfecciones de las versiones mutantes de VDR en células HEK293FT. Posteriormente, se efectuaron ensayos de interacción proteína-proteína de las versiones mutantes de VDR con GST-SUMOl, GST-SUM02 y GST-SUM03 mediante GST -pulldown. En su conjunto estos análisis, hacen posible proponer un mecanismo por el cual VDR recluta diferentes complejos correguladores durante la regulación transcripcional de un gen en respuesta a Vitamina D3.