Examinando por Autor "Sepúlveda, Romina"
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Ítem Análisis y elaboración de un modelo in silico para 2 proteasas romboides (AtRBL10 Y AtRBL13) de Arabidopsis thaliana para el estudio de la relación entre secuencia y función(Universidad Andrés Bello, 2022) Cifuentes Ahumada, Luis Felipe; Moreno Vilches, Adrián Andrés; Sepúlveda, Romina; Facultad de Ciencias de la VidaLas proteasas romboides son la familia más grande de enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos, dentro del entorno hidrófobo de la membrana celular. Si bien hace menos de 3 décadas fueron descubiertas y clasificadas como serina proteasas, ya se consideran como una de las proteasas intramembranas mejor comprendidas. Transformando a los bastos miembros de la familia, repartidos por todos los reinos de la vida, en potenciales reguladores de procesos complejos dentro de la célula; por lo que no es de sorprender que en organismo sésiles como las plantas, sean los que presenten más homólogos romboides, dando indicios de que esta superfamilia de enzimas, pudiese haber diversificado sus funciones en las células vegetales, conservando por lo menos la disposición espacial que debe adoptar para adaptarse a las distintas membranas celulares. Por lo que el conocer a cabalidad su estructura, siempre se ha tomado como objetivo clave para conocer el rol fisiológico y que puede ser pieza clave para el entendimiento de la proteólisis intramembrana regulada (RIP) y de cuanto está involucrada en la regulación homeostática de los organismos vegetales. En ausencia de estructuras tridimensionales experimentales, hay varios ejemplos donde la predicción computarizada ha generado grandes contribuciones en la predicción de nueva funciones proteicas, por lo que, un enfoque adecuado para comparar la funcionalidad de proteínas pertenecientes a la misma familia; como es el caso de las 2 romboides de la planta modelo A thaliana, AtRBL10 y AtRBL13. Gracias a los grandes avances en el desarrollo de la inteligencia artificial (IA) se han generado herramientas computacionales que han permitido manejar cantidades de información nunca vistas, generando predicciones cada vez más cercanas a las obtenidas experimentalmente, dándole mucho más valor y peso a los ensayos in silico. La anotación por homología ha sido uno de los métodos más utilizados para la anotación funcional de péptidos, especialmente de enzimas, donde se ha logrado la inferencia de nuevas familias de enzimas, gracias a la comparación en la composición de su secuencia con respecto de una de función conocida. Este método se basa en la suposición de que las proteínas con secuencias similares tendrán funciones similares. La anotación homológica es especialmente útil para estudiar la relación secuencia función de proteínas con pocos antecedentes disponibles o como el caso de las romboides, superfamilias recientemente descubiertas, que difieren bastante de las ya caracterizadas e inclusive entre ellas mismas. Se logra corroborar que mediante las nacientes herramientas biotecnologicas, labores que anteriormente, se obtenía mucha ambigüedad entre las predicciones obtenidas, como determinar el número de segmentos transmembrana (TMD) o la relación conservada en la secuencia aminoacídica de grupos con centenares de proteínas; ya se encuentran más democratizadas para su libre acceso, incluso para usuarios sin una mayor experiencia o conocimientos informáticos. Para esto fue necesario, la generación y depuración de un red de similitud de secuencia, esto con el objetivo de interrogar estas dos enzimas, abordando el desafío de vincular la información funcional descrita hasta la fecha, con la secuencia y las similitudes estructurales obtenidas, utilizando un redes de similitud de proteínas que permita dicha inspección pero desde una visión a gran escala de la familia, con un énfasis especial en los homólogos vegetales, pensando en dilucidar nuevas funciones aún no exploradas en plantas, para este tipo de enzimasÍtem Heterologous expression, purification and characterization of three novel esterases secreted by the lignocellulolytic fungus Penicillium purpurogenum when grown on sugar beet pulp(Elsevier Ltd, 2017) Oleas, Gabriela; Callegari, Eduardo; Sepúlveda, Romina; Eyzaguirre, JaimeThe lignocellulolytic fungus, Penicillium purpurogenum, grows on a variety of natural carbon sources, among them sugar beet pulp. Culture supernatants of P. purpurogenum grown on sugar beet pulp were partially purified and the fractions obtained analyzed for esterase activity by zymograms. The bands with activity on methyl umbelliferyl acetate were subjected to mass spectrometry to identify peptides. The peptides obtained were probed against the proteins deduced from the genome sequence of P. purpurogenum. Eight putative esterases thus identified were chosen for future work. Their cDNAs were expressed in Pichia pastoris. The supernatants of the recombinant clones were assayed for esterase activity, and five of the proteins were active against one or more substrates: methyl umbelliferyl acetate, indoxyl acetate, methyl esterified pectin and fluorescein diacetate. Three of those enzymes were purified, further characterized and subjected to a BLAST search. Based on their amino acid sequence and properties, they were identified as follows: RAE1, pectin acetyl esterase (CAZy family CE 12); FAEA, feruloyl esterase (could not be assigned to a CAZy family) and EAN, acetyl esterase (former CAZy family CE 10). © 2017 Elsevier LtdÍtem Increasing the intracellular isoprenoid pool in Saccharomyces cerevisiae by structural fine-tuning of a bifunctional farnesyl diphosphate synthase(2017-06) Rubat, Sebastián; Varas, Ignacio; Sepúlveda, Romina; Almonacid, Daniel; González-Nilo, Fernando; Agosin, EduardoFarnesyl diphosphate synthase (FPPS) is a key enzyme responsible for the supply of isoprenoid precursors for several essential metabolites, including sterols, dolichols and ubiquinone. In Saccharomyces cerevisiae, FPPS catalyzes the sequential condensation of two molecules of isopentenyl diphosphate (IPP) with dimethylallyl diphosphate (DMAPP), producing geranyl diphosphate (GPP) and farnesyl diphosphate (FPP). Critical amino acid residues that determine product chain length were determined by a comparative study of strict GPP synthases versus strict FPPS. In silico ΔΔG, i.e. differential binding energy between a protein and two different ligands-of yeast FPPS mutants was evaluated, and F96, A99 and E165 residues were identified as key determinants for product selectivity. A99X variants were evaluated in vivo, S. cerevisiae strains carrying A99R and A99H variants showed significant differences on GPP concentrations and specific growth rates. The FPPS A99T variant produced unquantifiable amounts of FPP and no effect on GPP production was observed. Strains carrying A99Q, A99Y and A99K FPPS accumulated high amounts of DMAPP-IPP, with a decrease in GPP and FPP. Our results demonstrated the relevance of the first residue before FARM (First Aspartate Rich Motif) over substrate consumption and product specificity of S. cerevisiae FPPS in vivo. The presence of A99H significantly modified product selectivity and appeared to be relevant for GPP synthesis. © FEMS 2017. All rights reserved. For permissions, please e-mail: journals.permissions@oup.com.Ítem Rational discovery of new capsaicin analogues as TRPV1 activators(BioMed Central Ltd., 2015-05) Cáceres, Javier; Sepúlveda, Romina; Navas, Camila; Latorre, Ramón; González-Nilo, Fernando