Examinando por Autor "Eyzaguirre Philippi, Jaime"

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    Propiedades y posible aplicación en la industria alimenticia de las a-Sa-L-arabinofuranosidasas del hongo penicillium purpurogenum
    (Universidad Andrés Bello, 2009) Ravanal Espinosa, María Cristina.; Eyzaguirre Philippi, Jaime; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    La lignocelulosa es la biomasa renovable más abundante en nuestro planeta. Está compuesta por lignina, pectina, celulosa y hemicelulosas. El xilano es el principal componente de las hemicelulosas. Está formado por una cadena principal de residuos P- 1,4-D-xilopiranósidos sustituida por diferentes tipos de residuos: metil glucuronato, Larabinofuranosa y acetato. La biodegradación del xilano es un proceso complejo que necesita la participación de una serie de esterasas y glicanasas. Entre estas Últimas se encuentran las a-L-arabinofuranosidasas (E.C. 3.2.1.55) que hidrolizan residuos de arabinosa unidos a la posición 2 y/ó 3 de la xilosa. El hongo filamentoso Penicillium purpurogenum, utilizado en este trabajo como modelo de estudio, crece en diferentes fuentes de carbono natural, secretando al medio en que se desarrolla una gran variedad de enzimas xilanolíticas, incluyendo tres a-Arabinofuranosidasas, denominadas ABF 1,2 y 3. Este trabajo está enfocado en completar la caracterización de ABF2 y principalmente en el estudio de ABF3. Las dos enzimas han sido purificadas a homogeneidad. El peso molecular determinado por electroforesis en condiciones desnaturantes es de 70.000 para ABF2 y 50.700 para ABF3. Al analizar sus propiedades cinéticas, utilizando el sustrato sintético p-nitrofenil-a- arabinofuranósido (pNPAra), se observó que ambas siguen una cinética de Michaelis- Menten, con valores de KM de 0,098 mM para ABF2 y 0,65 mM para ABF3. La temperatura óptima es de 60°C para ABF2 y de 50°C para ABF3. El pH óptimo es de 5,O para las dos ABFs. ABF3 muestra también actividad frente a p-nitrofeni1-B-Dxilopiranósido (pNPXyl) con una KM de 12 mM; es por lo tanto una enzima bifuncional. La acción sobre sustratos naturales mostró que las tres ABFs (ABF1, 2 y 3) tienen diferente especificidad de sustrato; ABF 1 actúa sobre polisacáridos desramificandolos, ABF2 no actúa sobre polisacáridos y ABF3 muestra mayor preferencia por arabinoxilano y xilooligosacáridos. Estos resultados confirman la hipótesis que las ABFs cumplen distintas funciones en la biodegradación de la lignocelulosa. El gen abf 3 y su cDNA fueron secuenciados y no se encontraron intrones. La proteína madura tiene 433 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 47.305. El análisis de la secuencia de ABF3 mostró que es una proteína modular; posee un dominio catalítico y módulo de unión a carbohidratos. De esta forma, ABF3 es la primera enzima bifuncional modular de eucariontes descrita dentro de la Familia 43 de las Glicosil Hidrolasas. Una posible aplicación de las a-L-arabinofuranosidasas ha sido estudiada en relación al aumento del aroma de los vinos. Se utilizó mosto de Moscatel de Alejandría para aislar los glicósidos a través de columnas C18 RP. La cantidad de monosacáridos (glucosa, arabinosa y xilosa) presentes en los glicósidos, fue determinada después de la hidrólisis ácida y fue comparada con la obtenida por hidrólisis enzimática. Para la hidrólisis enzimática se utilizaron las ABFs (1 y 3) y P-glucosidasa de P. purpurogenum. Las dos ABFs fueron activas frente a monoterpenil a-L-arabinofuranosilglucósidos con liberación de arabinosa. Si además se adicionaba P-glucosidasa se generaba glucosa y monoterpenos. Estos resultados son comparables a los obtenidos en experimentos similares utilizando preparaciones comerciales, lo que sugiere que las enzimas de P. purpurogenum pueden ser utilizadas en esta aplicación en particular.
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    Secuenciación y expresión en Pichia pastoris GS115 del gen que codifica para una alfa glucoronidasa de Penicillium purpurogenum y caracterización de la enzima heteróloga
    (Universidad Andrés Bello, 2011) Rosa, Lorena Natalia; Eyzaguirre Philippi, Jaime; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica
    La lignocelulosa es el principal componente de la pared celular de las plantas. A partir de la degradación de ésta se puede generar energía renovable para producir biocombustibles de segunda generación. Esta lignocelulosa está compuesta por lignina, pectinas, celulosa y hemicelulosas, donde el xilano es la hemicelulosa más abundante. Para la hidrólisis completa del xilano (estructura compleja) se requiere de numerosas enzimas que actúan sobre su cadena principal y otras enzimas desramificantes. Dentro de las enzimas desramificantes se encuentran las alfa glucuronidasas que son las enzimas hemicelulolíticas menos estudiadas. Las alfa glucuronidasas liberan ácido metil glucurónico a partir de glucuronoxilano. Penicillium purpurogenum es un hongo secretor de múltiples enzimas hemicelulolíticas y es el modelo de estudio de nuestro laboratorio. En el género Penicillium no han sido descritos estudios bioquímicos de alfa glucuronidasas, y esta Tesis tiene como objetivo identificar y caracterizar la enzima de este hongo. En esta Tesis se secuenció el gen que codifica para una alfa glucuronidasa de P. purpurogenum y el cDNA preparado a partir de mRNA extraído de cultivos líquidos de este hongo crecido en xilano de madera de abedul. Este gen tiene un tamaño de 2523 pb y carece de intrones. Este gen se expresó heterologamente en Pichia pastoris GS115 con el objetivo de realizar estudios bioquímicos de la enzima que tiene un tamaño de aproximadamente 100 kDa, un pH óptimo de 4,5-5,O y una temperatura óptima de 37 °C. Esta enzima actúa sobre xilooligosacáridos cortos y no así sobre xilano no hidrolizado. De acuerdo a estas características la alfa glucuronidasa de P. purpurogenum pertenece a la familia GH67.