Examinando por Autor "Gil Michell, Fernando Rafael"
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Ítem Estudio del efecto de la fuente de azúcar sobre la motilidad de roseburia inulinivorans y su relación con la formación de biopelícula(Universidad Andrés Bello, 2023) Palma López, Nicole Alejandra; Gil Michell, Fernando Rafael; Facultad de Ciencias de la VidaRoseburia es un género bacteriano conformado por cinco especies: Roseburia intestinalis, Roseburia hominis, Roseburia inulinivorans, Roseburia faecis y Roseburia cecicola, las cuales tienen la capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal de los seres humanos y producir ácidos grasos de cadena corta (AGCC) otorgando energía y propiedades antiinflamatorias al colon, siendo parte de la gran diversidad bacteriana que compone la microbiota intestinal. La microbiota intestinal es un ecosistema microbiano que habita en el tracto intestinal y forma una especie de simbiosis en la que las bacterias viven en el intestino otorgando propiedades que optimizan la homeostasis de nuestro organismo. Esta relación simbiótica es de suma importancia para la salud, incidiendo en el tránsito intestinal, correcto funcionamiento del colon, etc. Es así, como a lo largo de la historia, han ido aumentando la cantidad de estudios que permitan conocer la diversidad microbiana del intestino, para analizar su composición, funcionamiento y beneficios, además de poder comprender la forma en la que estas bacterias colonizan el intestino y lograr encontrar métodos que las resguarden de agentes antimicrobianos como los antibióticos, que al ingerirlos afectan negativamente a estas bacterias comensales, y a su vez, a nuestro sistema inmune. En este estudio se analizó el comportamiento fenotípico de cuatro cepas distintas de Roseburia inulinivorans en base a la capacidad de motilidad que posee cada cepa en distintas concentraciones de azúcares del medio. Se cree que la fermentación de azúcares tiene relación con la formación de butirato, un ácido graso involucrado en la obtención de ATP, lo que afectaría procesos celulares en Roseburia, además, se ha visto en otros ejemplares que la fuente de carbono afecta funciones como la motilidad. Posterior a esto, se estudió la capacidad formadora de biopelículas de cada cepa, contrastando los resultados obtenidos y evaluando si existe una relación entre la pérdida de motilidad y la formación de biopelículas.Ítem Expresión heteróloga de una bacteriocina de clase I proveniente de Bifidobacterium spp. en Escherichia coli”(Universidad Andrés Bello, 2020) Wolter Salas, Sebastián Andrés; Gil Michell, Fernando Rafael; Fuentes Aravena, Juan; Facultad de Ciencias de la VidaLa microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos existentes en el tracto gastrointestinal (TG) del ser humano, funcionando de manera simbiótica con el hospedero. En este ecosistema se pueden encontrar relaciones de competencia por nutrientes entre bacterias, lo que ha permitido la evolución de diferentes antimicrobianos producidos por las mismas bacterias, denominados bacteriocinas, que les permiten colonizar de manera exitosa el nicho ambiental. A su vez, esto ha llamado la atención para encontrar alternativas para antimicrobianos debido al incremento en la resistencia de antibióticos de diferentes microorganismos patógenos. Dentro de este contexto, se reportó la bacteriocina LanA, producida por algunas especies del género de Bifidobacterium. Este péptido antimicrobiano posee la capacidad de ser de amplio espectro para bacterias Gram positivo, incluyendo a Staphylococcus aureus. Producir esta bacteriocina posee dos problemáticas principales. Bifidobacterium es un microorganismo anaerobio y posee un ciclo de replicación lento. Además, el operón donde se encuentra codificada la bacteriocina se encuentra reprimido transcripcionalmente en cultivos de medio líquido, lo que dificultaría la producción y purificación de la bacteriocina. En base a lo anterior es que la expresión heteróloga en Escherichia coli BL21 (DE3) fue realizada para sobrepasar estas dificultades, permitiendo producir esta bacteriocina de manera rápida y activa biológicamente, aunque no exenta de problemas relacionados a la actividad reducida en base a una extracción de proteínas totales. Es por esto que este trabajo explora la posibilidad de fusionar el péptido señal de la βlactamasa con la bacteriocina LanA, con el objetivo de direccionar la expresión del péptido hacia el periplasma y mantener la bacteriocina activa biológicamente, concentrando a esta bacteriocina en esta región bacteriana y simplificando la extracción. Para ello se decidió amplificar la región codificante del gen de la bacteriocina desde el DNA total de microbiota de 5 individuos, logrando detectarla solo en 4 de ellos. En paralelo, se amplificó el péptido señal de la β-lactamasa desde un vector con resistencia a ampicilina, para posteriormente producir el overlapping entre estos dos fragmentos y proceder al clonamiento. De los tres clones positivos se extrajo la región periplasmática y las proteínas totales, posterior a la inducción, con el fin de enfrentar estos extractos contra microorganismos patógenos, demostrando que ninguna de las extracciones es activa contra os microorganismos probados en este estudio en medio liquido y sólido. El análisis de expresión relativa indicó que el gen de lanA está siendo expresado, por lo que el péptido señal podría tener algún efecto en la actividad biológica de la bacteriocina. En base a lo anterior, se comprueba que la bacteriocina LanA, fusionada con el péptido señal de la β-lactamasa puede ser expresada heterólogamente en E. coli BL21 (DE3), pero con la pérdida de su efecto biológico. Probablemente sea necesario aumentar el número de clones a evaluar para determinar la correcta producción de la bacteriocina fusionada al péptido señal. Además, es necesario generar un screening de diferentes péptidos señales para evaluar cuál es la mejor alternativa para producir esta bacteriocina, aislarla desde el periplasma y obtener una actividad biológica.Ítem Participación de los genes cysK y cysM en la resistencia a antibióticos bactericidas(Universidad Andrés Bello, 2017) Frávega Ammann, Jorge Matías; Gil Michell, Fernando RafaelLos antibióticos bactericidas, además de su efecto primario, producen un aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs) al interior de la bacteria debido al aumento en la razón NADt / NADH proveniente del Ciclo de Krebs. Ante esto, la bacteria es capaz de modificar el perfil de expresión génica, incluyendo una serie de genes y reguladores transcripcionales involucrados en el metabolismo del azufre. Uno de los sustratos para la síntesis de cisteína, el sulfuro de hidrógeno (H2S), durante años fue considerado como un sub-producto de desecho en las bacterias. Sin embargo, este compuesto es de gran interés ya que se ha demostrado que actúa como un antioxidante protegiendo a la bacteria ante EROs, probablemente estimulando enzimas antioxidantes como catalasas y SOD, secuestrando además del ion ferroso a la cisteína libre, los cuales promueven la reacción de Fenton. El paso final en la síntesis de cisteína es catalizado por las enzimas CysK ó CysM, codificadas por los genes cysK y cysM, las que utilizan H2S y O-Acetilserina (OAS) u OAcetilserina (OAS) y S2O3 respectivamente. Considerando que la cisteína en exceso promueve la reacción de Fenton y que los antibióticos bactericidas aumentan las EROs intracelulares, en el presente trabajo, postulamos que cepas de S. Typhimurium mutantes para cysK son más resistentes frente al tratamiento con ofloxacino (antibiótico bactericida perteneciente a las quinolonas), debido a que en dicha mutante se favorecería la acumulación de H2S (antioxidante) y se vería disminuida la acumulación de cisteína (prooxidante al estar en exceso). Mediante determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) y curvas de supervivencia, encontramos que la mutante ¿cysK es más resistente a ofloxacino. Además, esta cepa produce menos cisteína y acumula mayor cantidad de H2S frente al tratamiento con ofloxacino, sumado al hecho de que también presenta menos daño en el DNA en comparación a la cepa WT. Finalmente, al evaluar los niveles de transcrito del gen cysK en las cepas WT y OcysM, se observó una disminución durante el tratamiento con ofloxacino Estos resultados explicarían el aumento en la resistencia frente a ofloxacino, dando a conocer un nuevo mecanismo asociado a la resistencia a antibióticos.Ítem Participación de los sistemas Toxina-Antitoxina de Tipo II y proteasas Clp de C/ostridioides difficile R20291 en la generación de células persistentes y en fenotipos virulentos(Universidad Andrés Bello, 2020) Álvarez Espinosa, Ricardo Hernán; Gil Michell, Fernando Rafael; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias de la VidaEn las últimas décadas, se ha evidenciado un aumento en la frecuencia de patógenos bacterianos que tiene multirresistencia a fármacos y tolerancia a antibióticos. Los mecanismos clásicos de resistencia a antibióticos en patógenos bacterianos son generalmente causados por mutaciones o adquisición de genes de resistencia. Por el contrario, los mecanismos de tolerancia implican la aparición de células persistentes, las cuales son variantes fenotípicas de bacterias silvestres que contribuyen a la persistencia bacteriana en el hospedero. Estas células se generan principalmente frente a un ambiente estresante, pero también pueden generarse de forma estocástica. El mecanismo por el cual se forman ha sido difícil de dilucidar debido a que solo una pequeña fracción de la población se vuelve persistente, pero un factor común son las toxinas de los sistemas toxina-antitoxina (TA) y las proteasas Lon y Clp. Los sistemas TA están compuestos por dos genes, los que codifican para una toxina y su antitoxina afín. En condiciones normales de crecimiento, la antitoxir.a se forma un complejo con la toxina, lo que evita que esta última ejerza su efecto. Mientras que, frente al estrés ambiental causado por los antibióticos, se genera una baja en los niveles de la antitoxina, debido a su degradación por proteasas propias de la bacteria (Lon y Clp), produciéndose la liberación y activación de la toxina, lo que llevará a la inhibición del crecimiento y, por lo tanto, a la generación de células persistentes. Los sistemas TA han sido relacionados con la persistencia bacteriana en muchos patógenos bacterianos. Sin embargo, tanto la persistencia como la contribución de los sistemas TA de Tipo II y las proteasas Lon y Clp, no han sido estudiados en el patógeno nosocomial Clostridioides difficile. Este patógeno es el agente etiológico de las infecciones causadas por C. difficile, las cuales son responsables del 30% de las diarreas infecciosas asociadas al uso de antibióticos. Además, tiene gran capacidad de persistir en el hospedero, lo que contribuye a la alta tasa de infecciones recurrentes. En este trabajo determinamos que C. difficile forma células persistentes frente al tratamiento con antibióticos in vitro. Además, C. difficile R20291 posee 9 sistemas TA de Tipo II hipotéticos, de los cuales RelBE y MazEF son funcionales, poseen actividad endorribonucleasa y aumentan su expresión frente a vancomicina, la que es dependiente de la proteasa ClpP2 y la chaperona ClpC. Finalmente, ClpP2 y ClpC participan en formación de células persistentes, en la generación de biopelículas, motilidad, producción de toxinas, esporulación y adherencia a células epiteliales. Estos resultados sugieren que ClpP2 y ClpC contribuyen a la virulencia de C. diffici/e R20291.Ítem La proteína Omp W de salmonella enterica serovar typhimurium es requerida en el mecanismo de resistencia y expulsión de tóxicos desde la bacteria(Universidad Andrés Bello, 2008) Gil Michell, Fernando Rafael; Saavedra, Claudia;El transporte a través de la membrana externa (ME) de bacterias Gram negativo ocurre vía proteínas denominadas genéricamente porinas. Estas se organizan como homotrímeros formando canales acuosos que permiten el paso de solutos hidrofilicos y de bajo peso molecular (< 600 Da), siendo el periplasma isoosmótico con el medio extracelular. Las porinas clásicas presentan entre 12 y 22 hebras tipo B que forman el barril, a diferencia de las porinas denominadas pequeñas, que presentan entre 8 y 10 hebras tipo B En 1988 Morimyo aisló y caracterizó mutantes de Escherichia coli sensibles a metil viológeno. La región del genoma de E. coli ( 4 kpb) que contenía estas mutaciones, ubicada entre el operón triptofano y el gen tonB, fue utilizada en un estudio comparativo de genomas y se encontró que presenta pocas variaciones en las diferentes cepas analizadas. Río abajo del gen tonB se localiza el gen ompW, que codifica para una proteína de membrana externa con características de porina pequeña. Resultados preliminares de nuestro laboratorio indican que al igual que ompD, el gen omp W de Salmonella enterica serovar Typhimurium estaría involucrado en la resistencia de esta bacteria al tóxico metil viológeno (MV) y permiten especular que OmpW podría funcionar en conjunto con SmvA en la expulsión de MV y/o de algún otro producto de desecho derivado del estrés oxidativo. Evidencias recientes muestran que OmpW de Vibrio cholerae no se comportaría como una porina clásica al no permitir el ingreso de azúcares en experimentos de hinchado de liposomas. Este resultado apoyaría la idea de la participación de OmpW en la expulsión de tóxicos, y no necesariamente en la entrada de sustratos. Con la finalidad de comparar la susceptibilidad de la cepa silvestre de S. Typhimurium y sus derivadas mutantes ompW, ompD y ompW ompD, se determinó su susceptibilidad a MV en placas de medio mínimo suplementado con glucosa. Al igual que el mutante AsmvA la cepa smvA ompW mostró una sensibilidad a MV 12 veces mayor que la cepa silvestre. La complementación del mutante doble con el plasmidio pTOPO-ompW mostró el mismo fenotipo que la mutante simple 8.smvA. La complementación de células AsmvA !:iomp W con el plasrnidio pGEMT-smvAR mostró una sensibilidad a MV 1,8 veces mayor en relación a la cepa silvestre. Estos resultados sugieren que la bomba SmvA utilizaría una vía dependiente de OmpW en la expulsión del tóxico...Ítem Rol del sistema de dos componentes BaeSR de Salmonella Typhimurium en la modulación de la expresión de las superóxido dismutasas frente a ciprofloxacino(Universidad Andrés Bello, 2013) Guerrero Escudero, Patricio Juan José; Gil Michell, Fernando Rafael; Saavedra Sánchez, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaDurante su ciclo infectivo, Salmonella Typhimurium (S Typhimurium) debe adaptarse a diversos cambios medioambientales. Para ello, debe detectar y responder a las diferentes señales y condiciones a las que se ve enfrentada. Dentro de los mecanismos utilizados por S. Typhimurium y otras bacterias, se encuentran los sistemas de dos componentes (SDC), que consisten de una proteína localizada en la membrana interna y que actúa como un "sensor", y un factor transcripcional localizado en el citoplasma denominado "regulador de respuesta". Los SDC responden a diversas señales, incluyendo cambios en el pH, osmolaridad, antibióticos, etc, entre otras. En este contexto, ha sido reportado que el SDC BaeSR participa en la respuesta a ciprofloxacino (CIP), un antibiótico cuyo mecanismo de acción incluye la producción de la especie reactiva de oxígeno superóxido (Oz ). Para evitar el daño producido por esta molécula oxidante, el genoma de S. Typhimurium codifica tres isoformas de la enzima superóxido dismutasa (SOD), SodA, SodB y SodC, cuya función es la degradación de O . Dado que el SDC BaeSR responde a CIP y que este antibiótico genera OZ , se realizó un análisis in sulco de los promotores de sodA y soda en busca de posibles sitios de unión del regulador BaeR. El análisis predijo la presencia de dos sitios de unión de BaeR en el promotor de sodA (BBS 1 y BBS2), y uno en el promotor de soda (BBS). En base a estos antecedentes, se buscó establecer si el SDC BaeSR activa la expresión de sodA y sodB en respuesta a CIP. Los resultados de esta Tesis demuestran que el SDC BaeSR activa la expresión de sodA en respuesta a CIP a través de una interacción directa con el sitio BBS 1, que esta activación es independiente del regulador SoxS, y que BaeSR es requerido para mantener los niveles basales de soda a través de un mecanismo no identificado.Ítem Role of the R. inulinivorans flagellum in adherence to intestinal constituents and gut colonization(Universidad Andrés Bello, 2023) Díaz Yáñez, Fernando Javier; Gil Michell, Fernando Rafael; Facultad de Ciencias de la VidaLa microbiota intestinal (MI) humana, benéfica para la salud del ser humano, está dominada en su mayoría por dos filos bacterianos, Bacteroidetes y Firmicutes. La colonización intestinal por parte de estas bacterias es un proceso multifactorial en los que están implicados, entre otros, la motilidad y la adherencia a componentes del intestino. La motilidad mediada por flagelos cumple un rol fundamental en la colonización y virulencia de múltiples bacterias patógenas, sin embargo, la importancia de la motilidad flagelar en la colonización de bacterias comensales de la MI, en particular del filo Firmicutes, ha sido pobremente estudiada. El flagelo permite el movimiento de manera concertada en búsqueda de condiciones favorables en medios líquidos y semi sólidos, pero además actúa como adhesina a componentes del intestino como la mucina y células epiteliales. Roseburia inulinivorans (R. inulinivorans) es una bacteria de la microbiota intestinal de diferentes organismos, flagelada y que pertenece a un género importante de bacterias en la microbiota intestinal. Los determinantes genéticos que participan en la colonización de R. inulinivorans no han sido descritos, ya que no existen herramientas de manipulación genética sitio dirigidas en este género, aunque R. inulinivorans ha podido ser conjugada con plásmidos derivados de la línea pMTL, convirtiéndola en un buen candidato para la búsqueda de determinantes genéticos relacionados a la colonización de este género. Mediante mutagénesis química obtuvimos mutantes sin flagelo de R. inulinivorans (Fla- ), que posterior a la secuenciación del genoma completo de estas pudimos observar que las mutaciones generadas afectaban a las proteínas FlhB, FliM y FliP, del cuerpo basal del flagelo. Estas mutantes in vitro poseen una mayor formación de biopelículas y adherencia a células epiteliales, y por el contrario una menor adherencia a una capa de mucina. Las revertantes espontaneas generadas para cada mutante Fla- (rFla+) confirmaron que los fenotipos observados se produjeron por las mutaciones en las proteínas descritas previamente, excepto en FlhB. Interesantemente, las cepas revertantes poseen una mayor motilidad que la cepa silvestre, lo que podría ser explicado por mutaciones en las proteínas FliF o CheY, que forman en anillo MS del cuerpo basal o participan la regulación de la quimiotaxis, respectivamente. En la colonización de ratones no observamos diferencias significativas entre las cepas mutantes y silvestre, aunque desde las heces solo recuperamos cepas Fla- . Por lo tanto, los genes fliM y fliP son funcionales y necesarios en el ensamble del flagelo en R. inulinivorans y, además, la pérdida de este afecta de forma contraria la adherencia a las células epiteliales y mucina. Además, si bien no obtuvimos diferencias significativas en la colonización, observamos una tendencia que indicaría que en ausencia del flagelo R. inulinivorans favorecería la colonización intestinal.