Examinando por Autor "Prieto, Humberto"

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    Clonamiento y expresión heteróloga de tres genes que codifican para enzimas del tipo lipasa y proteasa, relacionadas con la actividad nematicida de Pseudomonas veronii R4
    (Universidad Andrés Bello, 2017) Barrientos Rios, Victoria; Prieto, Humberto; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    Pseudomonas veronii R4 es un nuevo aislado bacteriano que ha sido identificado previamente desde un panel de Pseudomonas ssp. fluorescentes con actividad nematicida. En particular, P. veronii R4, presenta actividad nematicida contra el fitopatógeno Xiphinema index, nematodo de importancia comercial en viticultura, debido a que es el principal vector del virus de la hoja en abanico de la vid (GFLV). Tras su caracterización y secuenciación de su genoma, se ha propuesto que esta actividad antagonista sobre X. index se debería a una batería enzimática que consiste en al menos una proteasa (AprA), una lipasa (LipA) y una fosfolipasa (ExoU). Con el objetivo de evaluar y confirmar la actividad nematicida de estas enzimas, en este trabajo de Tesis se clonaron los genes aprA, lipA y exoU (que codifican para las enzimas antes mencionadas) en vectores de entrada y expresión de la serie Gateway, utilizando como hospedero heterólogo la bacteria Escherichia coli BL21(DE3). La sobreexpresión de las proteínas recombinantes en el sistema de expresión produjo agregados de proteínas recombinantes, las cuales se debieron solubilizar y renaturalizar. Ensayos enzimáticos de extractos de enzimas recombinantes, AprA, LipA y ExoU, en los sustratos gelatina, tributirina y sangre, respectivamente, evidenciaron la funcionalidad de estas enzimas. Finalmente, la exposición de X. index frente a los extractos de proteínas enriquecidos con las enzimas AprA (500 μg/mL), LipA (50 μg/mL) y ExoU (50 μg/mL) recombinantes provocaron pérdida de movilidad mayor a 90% después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, evaluado a través de ensayos in vitro. Concordantemente, se observaron, mediante microscopia electrónica de barrido, daños estructurales en la cutícula, deshidratación y exposición de tejidos internos de los nematodos expuestos a los extractos de enzimas recombinantes. Los resultados obtenidos permiten confirmar que la actividad nematicida de la bacteria es causada por al menos las enzimas AprA, LipA y ExoU de R4, lo que además representa proyecciones de estas enzimas para su aplicación biotecnológica.
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    Comparative study of two table grape varieties with contrasting texture during cold storage
    (MDPI AG, 2015-03) Ejsmentewicz, Troy; Balic, Iván; Sanhueza, Dayan; Barria, Romina; Meneses, Claudio; Orellana, Ariel; Prieto, Humberto; Defilippi, Bruno G.; Campos-Vargas, Reinaldo
    Postharvest softening of grape berries is one of the main problems affecting grape quality during export. Cell wall disassembly, especially of pectin polysaccharides, has been commonly related to fruit softening, but its influence has been poorly studied in grapes during postharvest life. In order to better understand this process, the Thompson seedless (TS) variety, which has significantly decreased berry texture after prolonged cold storage, was compared to NN107, a new table grape variety with higher berry firmness. Biochemical analysis revealed a greater amount of calcium in the cell wall of the NN107 variety and less reduction of uronic acids than TS during cold storage. In addition, the activity of polygalacturonase was higher in TS than NN107 berries; meanwhile pectin methylesterase activity was similar in both varieties. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis (PACE) suggests a differential pectin metabolism during prolonged cold storage. Results revealed lower pectin fragments in TS after 60 days of cold storage and shelf life (SL) compared to 30 days of cold storage and 30 + SL, while NN107 maintained the same fragment profile across all time points evaluated. Our results suggest that these important differences in cell wall metabolism during cold storage could be related to the differential berry firmness observed between these contrasting table grape varieties. © 2015 by the authors
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    DNA methylation and small interference RNAs participate in the regulation of MADS-box genes involved in dormancy in sweet cherry (Prunus avium L.)
    (Oxford University Press, 2017-12) Rothkegel, Karin; Sánchez, Evelyn; Montes, Christian; Greve, Macarena; Tapia, Sebastián; Bravo, Soraya; Prieto, Humberto; Almeida, Andréa Miyasaka
    Epigenetic modifications can yield information about connections between genotype, phenotype variation and environmental conditions. Bud dormancy release in temperate perennial fruit trees depends on internal and environmental signals such as cold accumulation and photoperiod. Previous investigations have noted the participation of epigenetic mechanisms in the control of this physiological process. We examined whether epigenetic modifications were modulated in MADS-box genes, potential candidates for the regulation of bud dormancy and flowering in sweet cherry (Prunus avium L.). We identified and cloned two MADS-box genes homologous to the already-characterized dormancy regulators DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box (DAM3 and DAM5) from Prunus persica (L.) Batsch. Bisulfite sequencing of the identified genes (PavMADS1 and PavMADS2), Methylated DNA Immunoprecipitation and small RNA deep sequencing were performed to analyze the presence of DNA methylations that could be guided by non-coding RNAs in the floral buds exposed to differential chilling hours. The results obtained reveal an increase in the level of DNA methylation and abundance of matching small interference RNAs (siRNAs) in the promoter of PavMADS1 when the chilling requirement is complete. For the first intron and 5′ UTR of PavMADS1, de novo DNA methylation could be associated with the increase in the abundance of 24-nt siRNA matching the promoter area. Also, in the second large intron of PavMADS1, maintenance DNA methylation in all cytosine contexts is associated with the presence of homologous siRNAs in that zone. For PavMADS2, only maintenance methylation was present in the CG context, and no matching siRNAs were detected. Silencing of PavMADS1 and PavMADS2 coincided with an increase in Flowering Locus T expression during dormancy. In conclusion, DNA methylations and siRNAs appear to be involved in the silencing of PavMADS1 during cold accumulation and dormancy release in sweet cherry. © The Author 2017. Published by Oxford University Press. All rights reserved.
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    Identificación y caracterización de genes claves en el control de la dormancia en cerezo
    (Universidad Andrés Bello, 2013) González Vega, José Pablo; Miyasaka de Almeida, Andrea; Prieto, Humberto; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    Los árboles perennes como el cerezo, presentan un cese del crecimiento durante el invierno. En esta estación las yemas, tanto florales como vegetativas, dejan de crecer y entran en un estado de latencia llamado dormancia. La dormancia es definida como la inhabilidad de reanudar el crecimiento de un meristema, bajo condiciones favorables. Para salir de este estado, se necesita que el árbol pase por un periodo prolongado de frío que se denomina requerimiento de frío. Poco se sabe de la regulación molecular de este proceso y existe aún menos información en el cerezo (Prunus avium). Se sabe que la expresión de los genes DORMANCY ASSOCIA TED MADS-BOX (DAM) debe ser reprimida para que ocurra la salida de la dormancia. Las plantas anuales como Arabidopsis, pasan por un proceso llamado vernalización; éste también requiere un periodo de frío para que ocurra la transición del meristema vegetativo a reproductivo, donde actúa un gen ortólogo a los genes DAM, llamado FLOWERING LOCUS C (FLC) donde su expresión es reprimida epigeneticamente por un periodo largo de frio. Debido a la similitud entre el proceso vernalización en Arabidopsis, y el requerimiento en frío en árboles perennes, se buscaron putativos ortólogos de genes involucrados en el proceso de vernalización en el genoma de Prunus persica (duraznero). Se identificaron cinco posibles ortólogos de los genes VERNALIZA TION 5N/N3-LIKE1 (VRN5NIL1) , VERNALIZATION 2, (VRN2) , VIN3-LIKE 1 (VIL2/VEL1), VERNALIZATION 1 (VRN1) y FLOWERING LOCUS T (FT) . VIL1 , VEL1 y VRN2, que forman parte del complejo POL YCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2 (PRC2), involucrado en la represión epigenética del gen FLC. VRN1 es el encargado de mantener el estado de metilación en el tiempo y FT es un integrador y promotor floral. En este trabajo se evaluó la expresión de esos genes putativos y de los genes DAM en yemas florales de la variedad Bing a lo largo de la temporada 2012. Se observó que los genes VIL1, VEL1, VRN1, VRN2 y FT, mantuvieron una baja expresión hasta el 31 de agosto, al alcanzar aproximadamente 1300 unidades frío, donde mostraron un pico de expresión. DAM3 no presentó cambios significativo en las fechas estudiadas. Este estudio ha identificado por primera vez genes que tienen una expresión diferencial en yemas florales de cerezo y que podrían estar regulando el proceso de dormancia.
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    Silenciamiento a larga distancia mediante microRNAs artificiales
    (Universidad Andrés Bello, 2016) Quiroz Larraín, Daniela; Prieto, Humberto; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en Biotecnología
    Los micro RNAs (miRNAs) son moléculas de 21 ó 22 nucleótidos (nt) que dirigen el silenciamiento de un gen blanco produciendo un corte de su RNA mensajero o inhibiendo la expresión de éste. En plantas, cumplen un importante rol en diversos procesos del desarrollo, metabolismo y respuesta a estrés. Diversos estudios evidencian que el movimiento de ciertos miRNAs entre tejidos vegetales distantes ocurre, aunque también se ha descrito que algunos no poseen esta capacidad móvil. Con estas características, el silenciamiento génico mediante RNAs pequeños, incluyendo miRNAs, representa una herramienta biotecnológica relevante en áreas vinculadas al mejoramiento genético vegetal. En nuestro laboratorio se ha diseñado una estrategia sencilla de ensamblado de pre-miRNA artificial (amiRNA) utilizando un pre-miRNA endógeno de Vitis vinifera; este diseño ha permitido la expresión de un amiRNA funcional. Con la hipótesis de que este amiRNA es capaz de producir señales móviles, en la presente tesis se desarrollaron líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana expresando constitutivamente el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) y el amiRNA para silenciar dicho gen (amiRNA-GFP). Ambas líneas fueron utilizadas en experimentos de injertación recíproca. Resultados preliminares a las injertaciones, utilizando líneas doble transfomantes de N. benthamiana (miR+/GFP+), permitieron verificar un efectivo knockdown del gen blanco, lo que fue corroborado mediante análisis fenotípico vía microscopía, mostrando un descenso en la fluorescencia de las plantas re-transformadas. A nivel molecular preliminar, evaluaciones RT-PCR mostraron la expresión disminuida del gen GFP. Adicionalmente, un PCR de horquilla y la secuenciación masiva de RNAs pequeños de las líneas doble transgénicas generadas, permitieron detectar el miRNA artificial esperado, además de otras especies asociadas a éste, con tamaños entre 21 a 24-nt. Para evaluar la capacidad móvil del amiRNA-GFP, se injertaron las líneas GFP+ y miR+/GFP+, ya sea como portainjerto (pie) o como injerto (aéreo). Los resultados fenotípicos de estas plantas fueron analizados por microscopía de epifluorescencia y mostraron que existió una disminución de la fluorescencia verde de las plantas injertadas con plantas que expresaban el amiRNA-GFP, tanto al utilizar éstas como pie o como segmento aéreo; esto no fue observado en plantas GFP+ injertadas con los correspondierntes controles de plantas de Nicotiana no transgénicas (WT). Los resultados obtenidos indicarían que el silenciamiento de la expresión de GFP estaría mediado por un movimiento bidireccional del amiRNA-GFP diseñado, reforzando la eventual utilidad de esta herramienta en diversos estudios tanto básicos como aplicados.
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    Small RNA Differential Expression Analysis Reveals miRNAs Involved in Dormancy Progression in Sweet Cherry Floral Buds
    (MDPI, 2022-09) Soto, Esteban; Sanchez, Evelyn; Nuñez, Carlos; Montes, Christian; Rothkegel, Karin; Andrade, Paola; Prieto, Humberto; Miyasaka Almeida, Andrea
    In sweet cherry (Prunus avium), as in other temperate woody perennials, bud dormancy allows for survival in adverse environmental conditions during winter. During this process, environmental signals such as short days and/or low temperatures trigger internal signals that enable buds to become tolerant to the cold. The process involves tracking chilling units up to chilling the requirement fulfillment to resume growth, a transition involving transcriptional regulation, metabolic signaling, and epigenetic-related regulatory events. Massive sequencing of small RNAs was performed to identify miRNAs involved in sweet cherry dormancy by comparing their expression in field (regular seasonal) and controlled non-stop (continuous) chilling conditions. miRNAs highlighted by sequencing were validated using specific stem-loop PCR quantification, confirming expression patterns for known miRNAs such as miR156e, miR166c, miR172d, miR391, miR482c, and miR535b, as well as for newly proposed miRNAs. In silico prediction of the target genes was used to construct miRNA/target gene nodes. In particular, the involvement of the sweet cherry version for the miR156/SQUAMOSA PROMOTER-BINDING-LIKE PROTEIN genes whose expression was opposite in the two conditions suggests their involvement on dormancy regulation in sweet cherry. miRNA levels indicate that the regulation of stress-related genes and hormone synthesis modulates the expression of calcium metabolism and cell development-associated genes. Understanding the regulatory networks involved in sweet cherry dormancy, particularly in the context of miRNA involvement, represents the first step in the development of new agricultural strategies that may help overcome the increasing challenges presented by global climate change. © 2022 by the authors.