Examinando por Autor "Wilhelm, Vivian"

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    Estudio del sistema inmune de Salmo Salar
    (Universidad Andrés Bello, 2011) Lagos Rojas, Leidy Ximena; Rosemblatt S., Mario; Wilhelm, Vivian
    La salmonicultura es uno de los pilares de nuestra economía, de ahí la importancia en optimizar los niveles de sanidad y producción en dicha industria. En el presente estudio hemos demostrado el efecto de diferentes dietas comerciales en parámetros de inmunidad innata de salmón, tales como fosfatasa lisosomal, peroxidada lisosomal y estallido respiratorio. Nuestros resultados muestran la importancia de la adición de inmunoestimulantes en la alimentación para definir el estado inmunológico en peces. Por otro lado, se hace necesario la caracterización del sistema inmune, ya que de esta manera se puede optimizar y entender el mecanismo por el cual tanto enfermedades como inmunoestimulantes estarían ejerciendo su acción. Nuestros datos soportan la hipótesis que el sistema inmune de Salmo salar cuenta con poblaciones linfocitarias similares a las observadas en mamíferos, tales como linfocitos B (lgM+/MHCli+}; putativas APCs (MHCII++) y putativos linfocitos T (MHCU-). Dentro de estas células existen dos subpoblaciones capaces de incorporar antígeno, un tipo celular de gran tamaño y MHCII++, que podría corresponder a APCs y la otra corresponde a una característica particular de Salmo salar, que es la capacidad de linfoctios B de incorporar antígeno. Dado la escasez de anticuerpos para identificar las subpoblaciones mencionadas anteriormente, hemos desarrollado un sistema para detectar la presencia de APCs, haciendo uso de una de las vías coestimulatorias más comunes en vertebrados superiores, como lo es la interacción entre CD40L y CD40. En vertebrados superiores, la interacción CD40L-CD40 representa una importante vía coestimualtoria, crucial para la maduración de DCs, induciendo cambios fenotípicos y funcionales que transforman éstas células en células presentadoras de antígeno (APCs) más efectivas. Sin embargo, no existe evidencia de su conservación funcional en vertebrados inferiores, como salmón. Primeramente, hemos realizado la caracterización funcional de CD40L y CD40 de Salmo salar. CD40L de salmón es una proteína de transmembrana tipo 11 con un dominio funcional homólogo a TNF en el extremo extracelular que contiene el e-terminal, mientras que CD40 corresponde a una proteína de membrana tipo I con patrones de cuatro residuos de cisteína repetidos en su extremo N-extracelular. CD40L y CD40 se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes órganos de Salmo salar, particularmente en órganos relacionados con la función immune. Así, CD40L se encuentra expresado en una fracción celular identificada con linfocitos y su expresión es inducida por la acción de mitógenos tales como PHA y Con A. Por otro lado, CD40 es expresado en células con características de APCs y su expresión es inducida en presencia de CpG. Para determinar el efecto que tiene la unión de CD40L a su receptor CD40 en células de salmón, hemos ce-cultivado células CHSE-214 que sobreexpresan ectópicamente CD40L con leucocitos derivados de riñón cefálico y hemos demostrado que CD40L induce una rápida y duradera (6-72h) inducción en la expresión de transcritos codificantes para importantes moléculas coestimulatorias tales como CD40, CD83 y 87-H1, además de citoquinas características de respuesta tipo helper (IFNs, IL-12p40, IL-10 y IL-1 {3). lnteresantemente, la unión de CD40L en HKLs induce la expresión de MHCIIJ3 en la superficie de los leucocitos al tiempo que causa una disminución en su capacidad de capturar antígeno. Nuestros resultados proveen la primera evidencia de la existencia funcional de la vía coestimualtoria CD40L-CD40 en peces y demuestran que su interacción es clave en la maduración de APCs en Salmo salar. En conjunto nuestros datos permiten el enriquecimiento en el conocimiento de la inmunidad en vertebrados inferiores, crucial para el mejoramiento en estrategias de inmunoestimulación y además permitiría dilucidar el mecanismo evolutivo del sistema inmune en vertebrados superiores.
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    Identificación de Linfocitos B en pez cebra
    (Universidad Andrés Bello, 2013) Rubio Ahumada, Solange; Rosemblatt, Mario; Allende, Miguel; Wilhelm, Vivian
    El pez cebra como modelo ofrece diversas ventajas para el estudio del sistema inmune tanto innato como adquirido entre las que se cuentan su transparencia en los estadios iniciales del desarrollo, fácil manipulación y la disponibilidad de poderosas metodologías genéticas y moleculares. Se ha descrito que los peces poseen células con características similares a los linfocitos B y T de otros vertebrados. Dadas las ventajas mencionadas, el pez cebra es un buen modelo para estudiar estas poblaciones linfoides. Sin embargo, un inconveniente importante en este campo es la falta de herramientas inmunológicas tales como anticuerpos monoclonales que permitan aislar diferentes linajes linfoides y así poder caracterizar estos componentes celulares del sistema inmune de teleósteos. Aunque, aparentemente, muchos de los elementos esenciales del sistema inmune adquirido entre mamíferos y teleósteos son conservados, existen diferencias entre ellos, como la ausencia de médula ósea en los peces, cuya función como órgano hematopoyético en mamíferos, es desempeñada por el riñón en los teleósteos. Es en el riñón donde podemos encontrar linajes hematopoyéticos similares a los de médula ósea de mamíferos. Por otro lado y en contraste a lo que ocurre en mamíferos, los peces tienen sólo cuatro tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgZ e IgT. Entre estas, la IgM es la única que desempeña un papel importante en la respuesta inmune humoral de los teleósteos. Además de ser la inmunoglobulina más abundante en el suero de los peces, se encuentra presente en la superficie celular de los linfocitos B, lo cual permite usarla como marcador para esta subpoblación linfoide. A pesar de los antecedentes descritos, los linfocitos B de teleósteos están pobremente caracterizados, por lo cual, el objetivo de este trabajo fue avanzar en la caracterización de los linfocitos B en el pez cebra. Para ello utilizamos un anticuerpo monoclonal anti-IgM de salmónido, preparado previamente y establecimos que reconoce esta inmunoglobulina también en pez cebra. Por otro lado, aprovechamos la isponibilidad de distintas líneas de pez cebra transgénicas, entre ellas: rag2::GFP, que permite identificar linfocitos inmaduros, mhc2dab::GFP que marca células presentadoras de antígeno y cd45::DsRed, que marca una subpoblación de células mieloides y linfocitos T. Con estas herramientas, separamos las distintas subpoblaciones linfoides, mediante cell sorting y analizamos, a través de PCR en tiempo real, la expresión de los marcadores linfoides IgM, pax5 (gen clave en la diferenciación del linaje B), rag2 (determinante en el proceso de recombinación génica en linfocitos B y T) y Ick (codifica para una kinasa presente sólo en linaje T). Finalmente, aislamos las células I~My+ a nalizamos la habilidad de estas células de fagocitar material inerte y bacterias. En este estudio se logró identificar células I~M' en riñón, bazo y sangre de peces cebra adultos. Mediante citometría, demostramos que alrededor del 4% de todas las células renales presentan la expresión de IgM en la superficie celular. Estas células constituyen una subpoblación de linfocitos B, como se indica por los análisis de expresión de genes pax5 e IgM y la co-expresión del transgén mhc2dab::GFP. Además, se identificaron las células I ~ M a+is ladas a partir de riñón de la línea transgénica rag2::GFP (que marca las células progenitoras linfoides) lo que permitió discriminar subconjuntos discretos de diferentes estados de desarrollo de las células B (estadios del linaje B inmaduros y maduros). Además, se observó, a través de citometría de flujo y microscopía fluorescente, que las células que fagocitan micropartículas de poliestireno o bacterias, no expresan IgM en su superficie y no pueden ser identificadas como linfocitos B como se ha reportado en trucha y salmón. Haber identificado y separado linfocitos B en pez cebra es un logro que contribuye a nuestra comprensión del sistema inmune adaptativo de este teleósteo y que nos permitirá en un futuro aplicar este conocimiento a otras especies de teleósteos, incluyendo aquellas de interés comercial.
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    Production and immune response of recombinant Hsp60 and Hsp70 from the salmon pathogen Piscirickettsia salmonis
    (Sociedad de Biología de Chile, 2005) Wilhelm, Vivian; Soza, Cristian; Martinez, Rodrigo; Rosemblatt, Mario; Burzio, Luis; Valenzuela, Pablo D.T.
    We have isolated and sequenced the genes encoding the heat shock proteins 60 (Hsp60) and 70 (Hsp70) of the salmon pathogen Piscirickettsia salmonis. The sequence analysis revealed the expected two open reading frames that encode proteins with calculated molecular weights of 60,060 and 70,400. The proteins exhibit a 70-80% homology with other known prokaryotic Hsp60 and Hsp70 sequences. The coding regions have been expressed in E. coli as thioredoxin fusion proteins. Both recombinant proteins were shown to elicit a humoral response when injected intraperitoneally in Atlantic salmon and also conferred protection to fish challenged with P. salmonis. The present data will facilitate further studies on the involvement of heat shock proteins in protective immunity of fish to infection by P. salmonis and their potential use in recombinants vaccines against this intracellular pathogen.