Obtención de un panel de esfingomielinasas de Loxosceles boneti, gaucho, intermedia y reclusa, y su aplicación en la evaluación de aptámeros antitoxina de Loxosceles laeta como base de un medicamento antiloxoscélico panamericano
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Fecha
2018
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
Loxoscelismo cutáneo y loxoscelismo viscerocutáneo son formas del cuadro clínico generado por la mordedura de las arañas del género Loxosceles, conocidas como “arañas de rincón”. El envenenamiento se caracteriza por lesiones dermonecróticas y hemólisis. En su forma más grave puede causar daño renal y muerte. En el continente americano las especies Loxosceles boneti, Loxosceles gaucho, Loxosceles intermedia, Loxosceles laeta y Loxosceles reclusa son responsables de la mayoría de los casos reportados. La toxina principal del veneno es la esfingomielinasa D (SMD). Está presente en varias isoformas cuya proporción varía y genera dermonecrosis y hemólisis por sí sola. No existen tratamientos seguros y eficaces, solo se aplican tratamientos paliativos y antisueros de caballo capaces de producir reacciones anafilácticas y de eficacia no demostrada.
Los aptámeros son oligonucleótidos de RNA o DNA de hebra simple capaces de unirse a un blanco molecular e incluso inhibir su actividad biológica. Se obtienen mediante selección iterativa (SELEX), no son inmunogénicos y se sintetizan químicamente, constituyendo una buena alternativa para desarrollar un antídoto panamericano en base a aptámeros inhibitorios de múltiples isoformas de la SMD.
Se construyó un panel de cuatro esfingomielinasas recombinantes —Lb1 (Loxosceles boneti), Lg1 (Loxosceles gaucho), LiP1 (Loxosceles intermedia) y Lr1 (Loxosceles reclusa)— para evaluar la capacidad inhibitoria de tres aptámeros de RNA de 78 nucleótidos (K40, K42 y K66) inhibitorios de tres isoformas de la SMD de Loxosceles laeta (Ll1, Ll2 y LlPLD1).
Se sintetizó el gen que codifica la isoforma Lr1 de Loxosceles reclusa mediante ensamblaje de oligonucleótidos largos y se optimizó la producción de las proteínas recombinantes que conforman el panel de esfingomielinasas.
Los tres aptámeros resultaron ser inhibitorios de la actividad esfingomielinásica de las isoformas del panel: 11-20% con K40, 12-22% con K42 y 1-25% con K66. Todos los aptámeros inhiben al menos tres de las cuatro isoformas del panel y cada isoforma es inhibida por al menos dos de los aptámeros, siendo K40 y K42 los mejores candidatos para desarrollar un antídoto antiloxoscélico panamericano.
Cutaneous loxoscelism and viscerocutaneous loxoscelism are clinical variants of the envenomation generated by the bite of spiders of the genus Loxosceles, known as brown spiders. Poisoning is characterized by dermonecrotic lesions and hemolysis. In its most severe form it can cause kidney damage and death. In the Americas, the species Loxosceles boneti, Loxosceles gaucho, Loxosceles intermedia, Loxosceles laeta and Loxosceles reclusa are responsible for the majority of cases. The main toxin of the poison is sphingomyelinase D (SMD). It is present in several isoforms which vary in their relative amounts and it can generate dermonecrosis and hemolysis on its own. There are no safe and effective treatments, only palliative measures and horse antisera of unproven efficacy and capable of producing anaphylactic reactions. Aptamers are single-stranded RNA or DNA oligonucleotides capable of binding to a molecular target and of inhibiting its biological activity. They are obtained by an iterative selection process (SELEX), are not immunogenic and are synthesized chemically, constituting a good alternative for the development of a Panamerican antidote based on aptamers capable of inhibiting multiple SMD isoforms. A panel of four recombinant sphingomyelinases —Lb1 (Loxosceles boneti), Lg1 (Loxosceles gaucho), LiP1 (Loxosceles intermedia) and Lr1 (Loxosceles reclusa)— was obtained and used to evaluate the inhibitory capacity of three RNA aptamers of 78 nucleotides (K40, K42 and K66) which are inhibitors of three SMD isoforms of Loxosceles laeta (Ll1, Ll2 and LlPLD1). The gene encoding the Lr1 isoform of Loxosceles reclusa was synthesized by assembling oligonucleotides and the production of the four recombinant sphingomyelinases that make up the panel was optimized. The three aptamers inhibit the sphingomyelinase activity of the panel SMD isoforms achieving inhibitions of 11-20% with K40, 12-22% with K42 and 1-25% with K66. All aptamers inhibit at least three of the four isoforms and each isoform of the panel is inhibited by at least two of the aptamers, K40 and K42 being the best candidates for developing a Panamerican antiloxoscellic antidote.
Cutaneous loxoscelism and viscerocutaneous loxoscelism are clinical variants of the envenomation generated by the bite of spiders of the genus Loxosceles, known as brown spiders. Poisoning is characterized by dermonecrotic lesions and hemolysis. In its most severe form it can cause kidney damage and death. In the Americas, the species Loxosceles boneti, Loxosceles gaucho, Loxosceles intermedia, Loxosceles laeta and Loxosceles reclusa are responsible for the majority of cases. The main toxin of the poison is sphingomyelinase D (SMD). It is present in several isoforms which vary in their relative amounts and it can generate dermonecrosis and hemolysis on its own. There are no safe and effective treatments, only palliative measures and horse antisera of unproven efficacy and capable of producing anaphylactic reactions. Aptamers are single-stranded RNA or DNA oligonucleotides capable of binding to a molecular target and of inhibiting its biological activity. They are obtained by an iterative selection process (SELEX), are not immunogenic and are synthesized chemically, constituting a good alternative for the development of a Panamerican antidote based on aptamers capable of inhibiting multiple SMD isoforms. A panel of four recombinant sphingomyelinases —Lb1 (Loxosceles boneti), Lg1 (Loxosceles gaucho), LiP1 (Loxosceles intermedia) and Lr1 (Loxosceles reclusa)— was obtained and used to evaluate the inhibitory capacity of three RNA aptamers of 78 nucleotides (K40, K42 and K66) which are inhibitors of three SMD isoforms of Loxosceles laeta (Ll1, Ll2 and LlPLD1). The gene encoding the Lr1 isoform of Loxosceles reclusa was synthesized by assembling oligonucleotides and the production of the four recombinant sphingomyelinases that make up the panel was optimized. The three aptamers inhibit the sphingomyelinase activity of the panel SMD isoforms achieving inhibitions of 11-20% with K40, 12-22% with K42 and 1-25% with K66. All aptamers inhibit at least three of the four isoforms and each isoform of the panel is inhibited by at least two of the aptamers, K40 and K42 being the best candidates for developing a Panamerican antiloxoscellic antidote.
Notas
Tesis (Magíster en Biotecnología)
LUGAR DE REALIZACIÓN: Laboratorio de Farmacoterapia Génica Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile. FINANCIAMIENTO LFTG-UCH/14-04 LFTG-UCH/17-05 PEEI-FCQF/2017 Universidad Andrés Bello: Apoyo a la participación en CONEIBUdeC, 2017
Parte de este trabajo se ha presentado en los siguientes eventos científicos: - VI Congreso de Estudiantes de Ingeniería en Biotecnología (CONEIBUdeC) Universidad de Concepción (UdeC) Concepción, Chile, 17 al 20 de octubre de 2017 Premio: Primer Lugar Categoría Póster. - VI Encuentro de Tesistas de Ingeniería en Biotecnología de la Universidad Andrés Bello Centro de Investigación Marina Quintay (CIMARQ) Quintay, Valparaíso, Chile, 2 de noviembre de 2017.
LUGAR DE REALIZACIÓN: Laboratorio de Farmacoterapia Génica Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile. FINANCIAMIENTO LFTG-UCH/14-04 LFTG-UCH/17-05 PEEI-FCQF/2017 Universidad Andrés Bello: Apoyo a la participación en CONEIBUdeC, 2017
Parte de este trabajo se ha presentado en los siguientes eventos científicos: - VI Congreso de Estudiantes de Ingeniería en Biotecnología (CONEIBUdeC) Universidad de Concepción (UdeC) Concepción, Chile, 17 al 20 de octubre de 2017 Premio: Primer Lugar Categoría Póster. - VI Encuentro de Tesistas de Ingeniería en Biotecnología de la Universidad Andrés Bello Centro de Investigación Marina Quintay (CIMARQ) Quintay, Valparaíso, Chile, 2 de noviembre de 2017.
Palabras clave
Araña de Rincón, Antídotos, Aptámeros Nucleotídicos