Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado
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Ítem Identificación y caracterización de genes inducidos por exceso de Boro en Chenopodium quinoa(Universidad Andrés Bello, 2015) Galleguillos de la Fuente, María Jesús; Krauskopf, Erwin; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaQuínoa o Chenopodium quina es una planta nativa del altiplano andino que se adapta a las condiciones extremas de su entorno como a altos contenidos de boro en el suelo, de hecho se determinó previamente que el ecotipo R-49 presenta tolerancia a altas concentraciones de Boro. El boro es un elemento esencial para las plantas por formar parte de la pared de las células vegetales, pero su exceso produce toxicidad. Existen mecanismos descritos por los cuales algunas especies vegetales poseen tolerancia al exceso de boro en su medio de crecimiento, entre los que destacan la variación en la expresión de algunos transportadores de boro como NIP5;1, BOR1 y BOR4. A través de técnicas de secuenciación masiva como RNA-Seq se han identificado transcritos que caracterizan la respuesta a distintos estrés abióticos. Por esta razón, se utilizó esta técnica para estudiar la respuesta de quínoa frente a una situación de exceso de boro con el objetivo de identificar posibles transcritos asociados a la tolerancia de esta planta. A partir del estudio de los transcritos que más variaron su expresión en el RNA-Seq, se identificaron una serie de posibles proteínas asociadas a respuesta a estrés. Destacó el componente c186654 gl, el cual codifica para una proteína putativa denominada CgREB. A través de análisis in silico se identificaron entre 2 a 3 dominios transmembrana y posibles modificaciones post-traduccionales dentro de las que destaca la miristoilación. Por lo que se propone que CgREB podría formar parte de la cadena de transducción de señales en respuesta a un exceso de boro. Por otro lado, a través del estudio de los transportadores de boro en el transcriptoma de referencia construido a través del RNA-Seq, se identificó el componente c171835_gl_i2 como un posible ortólogo de NIP5;1 en quínoa (CgNIP5;1), debido a que presenta las características aminoacídicas que posee este canal en otros organismos vegetales. Por último, se confirmó por PCR en tiempo real el aumento de la expresión relativa frente a un exceso de boro de los componentes que codifican para CgREB y CgNIP5;1. Se sugiere que CgNIP5;1 participaría en la tolerancia de Chenopodium quina a las altas concentraciones de ácido bórico.Ítem Rol del RNA no codificante SroC en la motilidad de Salmonella Typhimurium(Universidad Andrés Bello, 2016) Fuentes Peña, Danitza Natalia; Calderón, Iván; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa regulación de la expresión génica en bacterias incluye la interacción de diversos tipos de moléculas, tales como el apareamiento de bases de los RNAs pequeños no codificantes (sRNAs) con sus respectivos RNAs mensajeros blanco. SroC, un sRNA de Salmonella Typhimurium con función desconocida hasta ahora, se expresa principalmente en la fase exponencial tardía de crecimiento. Mediante un análisis bioinformátivo se determinó que los genes flagelares flhB, fliE y fliJ son posibles blancos de SroC. Interesantemente, la expresión de estos genes flagelares es reprimida en fase exponencial tardía de crecimiento. En este trabajo se propuso determinar el rol de SroC en la regulación negativa de la motilidad de S. Typhimurium y la consecuente transición a un estado sésil de biopelícula. La evaluación del fenotipo mótil, permitió establecer que la cepa mutante deficiente en SroC (AsroC) posee mayor motilidad, mientras que la que sobreexpresa SroC (pSroC) muestra un fenotipo no motil, en comparación con la cepa silvestre. Mediante microscopía electrónica se determinó que la cepa pSroC no presenta flagelos y se agrega, a diferencia de la mutante que mas bien presenta un fenotipo hiperflagelado. Estos resultados se correlacionan con la formación de biopelícula, donde la ausencia de SroC reduce la formación de biopelícula mientras que la sobrexpresión de SroC la aumenta. Por otra parte, la expresión de los genes flagelares identificados como posibles blancos de SroC aumenta en la cepa dsroC, mientras que en la cepa pSroC disminuye significativamente, sugiriendo un rol regulador negativo por parte del sRNA. Ensayos de co-expresión heteróloga utilizando pSroC y fusiones traduccionales reporteras de los genes flagelares, demuestran que SroC interacciona directamente con los mRNAs flhB y fliJ. Los resultados en su conjunto indican que el sRNA SroC de S. Typhimurium regula la síntesis flagelar mediante la inhibición directa y post-transcripcional de la expresión de flhB y fliJ e indirectamente la expresión de fllE, estimulando a su vez la formación de biopelícula en la bacteria.Ítem Participación de los genes cysK y cysM en la resistencia a antibióticos bactericidas(Universidad Andrés Bello, 2017) Frávega Ammann, Jorge Matías; Gil Michell, Fernando RafaelLos antibióticos bactericidas, además de su efecto primario, producen un aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs) al interior de la bacteria debido al aumento en la razón NADt / NADH proveniente del Ciclo de Krebs. Ante esto, la bacteria es capaz de modificar el perfil de expresión génica, incluyendo una serie de genes y reguladores transcripcionales involucrados en el metabolismo del azufre. Uno de los sustratos para la síntesis de cisteína, el sulfuro de hidrógeno (H2S), durante años fue considerado como un sub-producto de desecho en las bacterias. Sin embargo, este compuesto es de gran interés ya que se ha demostrado que actúa como un antioxidante protegiendo a la bacteria ante EROs, probablemente estimulando enzimas antioxidantes como catalasas y SOD, secuestrando además del ion ferroso a la cisteína libre, los cuales promueven la reacción de Fenton. El paso final en la síntesis de cisteína es catalizado por las enzimas CysK ó CysM, codificadas por los genes cysK y cysM, las que utilizan H2S y O-Acetilserina (OAS) u OAcetilserina (OAS) y S2O3 respectivamente. Considerando que la cisteína en exceso promueve la reacción de Fenton y que los antibióticos bactericidas aumentan las EROs intracelulares, en el presente trabajo, postulamos que cepas de S. Typhimurium mutantes para cysK son más resistentes frente al tratamiento con ofloxacino (antibiótico bactericida perteneciente a las quinolonas), debido a que en dicha mutante se favorecería la acumulación de H2S (antioxidante) y se vería disminuida la acumulación de cisteína (prooxidante al estar en exceso). Mediante determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) y curvas de supervivencia, encontramos que la mutante ¿cysK es más resistente a ofloxacino. Además, esta cepa produce menos cisteína y acumula mayor cantidad de H2S frente al tratamiento con ofloxacino, sumado al hecho de que también presenta menos daño en el DNA en comparación a la cepa WT. Finalmente, al evaluar los niveles de transcrito del gen cysK en las cepas WT y OcysM, se observó una disminución durante el tratamiento con ofloxacino Estos resultados explicarían el aumento en la resistencia frente a ofloxacino, dando a conocer un nuevo mecanismo asociado a la resistencia a antibióticos.Ítem Análisis del perfil de metilación de DNA en el genotipo F del virus de la hepatitis B(Universidad Andrés Bello, 2015) Flores León, Yvo; Loyola Pedevila, Alejandra; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias BiológicasEl DNA circular covalentemente cerrado (cccDNA) del virus de la hepatitis B (HBV) es el causante de la persistencia viral en infecciones crónicas. Este cccDNA, organizado como un minicromosoma en el núcleo del hepatocito infectado, se encuentra metilado en sitios CpG en al menos dos de los diez genotipos de HBV descritos (genotipos A y D). Con el objetivo de identificar metilaciones de DNA en el genotipo de HBV prevalente en Chile (genotipo F), se utilizó un sistema de cultivo en células hepáticas humanas Huh7 transfectadas con el genoma viral. El cccDNA aislado se digirió con la enzima de restricción HpaII, sensible a metilación de DNA. Mediante PCR en tiempo real se determinó el Índice de Metilación (IM) en 3 sitios HpaII situados en la Isla CpG II (CpG II); Isla CpG III (CpG III) y dentro del ORF del gen S (CpG S). El IM de estos 3 sitios CpG sugiere que la molécula de cccDNA del genotipo F se encuentra metilada luego de 24 h post-transfección. Además, estudiamos la dinámica de la metilación del cccDNA, utilizando el inhibidor de DNA metiltransferasas procaína, el cual disminuyó el IM de los sitios CpG II y CpG S. Al utilizar inhibidores de enzimas que modifican la cromatina como es el butirato de sodio (un inhibidor de desacetilasas de histonas), y la pargilina (un inhibidor de la desmetilasa de histona H3, LSD1), se observó que el butirato de sodio aumentó significativamente el TM tanto en CpG II como en CpG III, mientras que, por el contrario, la pargilina no afectó la metilación del cccDNA. Por lo tanto, nuestro trabajo entrega evidencias del estado de metilación del intermediario de replicación del genotipo F de HBV. Lo anterior es un antecedente importante para investigar y entender la regulación de la transcripción y replicación de este virus hepatótropo.Ítem Efecto de mutaciones en sitios potenciales de fosforilación del dominio de la polimerasa del virus de la hepatitis C en la replicación del genoma viral(Universidad Andrés Bello, 2015) Figueroa Figueroa, Daniella Ruth; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias BiológicasLa fosforilación es un mecanismo conocido de regulación de la actividad de diversas proteínas. Dentro de la amplia variedad de proteínas que pueden ser blanco de la acción de kinasas, se encuentran las RNA polimerasas de los virus de RNA de hebra positiva. Una de aquellas enzimas, la proteína NS5B, es la principal encargada de la replicación del genoma del virus de la hepatitis C (HCV). La evidencia sugiere que su actividad podría estar modulada de manera positiva por fosforilación y se ha propuesto anteriormente que los residuos de seria en las posiciones 46, 76, 84, 96, 99 y 112 podrían participar en aquella forma de regulación. Para estudiar lo anterior, se utilizaron replicones subgenómicos de HCV con mutaciones puntales en los residuos de seria señalados, para eliminar la posibilidad de fosforilación o para simular una fosforilación constitutiva en aquellas posiciones. El efecto de dichas mutaciones se analizó en el contexto de los niveles de replicación de los replicones subgenómicos en base ala formación de colonias celulares resistentes a G418 (marcador de resistencia otorgado por los replicones). Los resultados sugieren que las serinas en las posiciones 46, 76 y 99 podrían participar en la regulación de la actividad de NS5B mediante fosforilación. Además, es posible que la fosforilación tenga efectos opuestos dependiendo del residuo que se encuentre fosforilado, ya que la simulación de una fosforilación en las serinas 46 y 76 produce un aumento en los niveles de replicación de replicones subgenómicos, mientras la fosforilación del residuo 99 resulta en una disminución significativa en la replicación del replicón mutante.Ítem Comparación del efecto antifúngico de Clonostachys spp. y Chaetomium spp. sobre Botrytis cinerea : caracterización de las moléculas producidas por el mejor biocontrolador(Universidad Andrés Bello, 2015) Fernández Céspedes, Kamila Paz Margarita; Polanco O., Rubén; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaBotrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que infecta una amplia variedad de frutas y hortalizas, causando la pudrición gris. Uno de los blancos de este fitopatógeno es la uva de mesa de exportación, provocando pérdidas económicas importantes para Chile. Actualmente se utilizan fungicidas químicos para controlar la infección provocada por Botrytis, sin embargo, se ha observado la aparición de cepas resistentes y efectos secundarios. Una alternativa al uso de fungicidas químicos son los controladores biológicos, pero a nivel comercial sólo Trichoderma spp. y Bacillus subtilis, han sido utilizados en precosecha. En nuestro laboratorio se aisló una cepa de Clonostachys rosea (RP1505) y una cepa de Chaetomium globosum (RP2808) capaces de controlar a Botrytis en condiciones de poscosecha de uva de mesa. Según lo reportado en la literatura, C. rosea es mejor biocontrolador de B. cinerea que C. globosum, pero estudios con las cepas de nuestro laboratorio indican lo contrario. Con el objeto de comprender mejor este fenómeno nos planteamos la siguiente hipótesis: La cepa RP2808 es mejor biocontrolador de B. cinerea que la cepa RP1505, ya que produce una mayor diversidad de metabolitos difusibles y termoestables. Se establecieron las mejores condiciones de cultivo de la cepa RP2808 y RP1505 para la producción de metabolitos termoestables con actividad biocontroladora sobre B. cinerea. Utilizando solventes de distinta polaridad, se aislaron los metabolitos contenidos en los extractos con mayor actividad antifúngica de cada cepa y se determinó que la cepa RP2808 produce metabolitos polares y apoares con actividad sobre el crecimiento y la germinación de B. cinerea. En cambio, la cepa RP1505 solamente produce metabolitos polares con actividad antifúngica contra B. cinerea. Mediante análisis de HPLC-MS se identificaron 2 posibles moléculas producidas por RP2808 en medio sólido, que presentan en su estructura un grupo fenilpirrol, descrito en otras moldculas con actividad botricida, por lo que serian responsables del efecto antifúngico.Ítem Efecto de extracto de cáscara de quinua sobre el crecimiento y germinación de Botrytis cinerea y Penicillium italicum : evaluación del posible mecanismo de acción(Universidad Andrés Bello, 2019) Farías González, María José; Palma G., Francisco; Silva Moreno, Evelyn; Krauskopf, Erwin; Facultad de Ciencias BiológicasLos cítricos son los cultivos frutales más importantes a nivel mundial y constituyen una excelente fuente de nutrientes y antioxidantes. La contaminación por hongos es un problema asociado al cultivo de cítricos, lo que genera grandes pérdidas económicas. En los cítricos, los hongos que tienen mayor incidencia son Penicillium italicum (causante del moho azul) y Botrytis cinerea (causante del moho gris). Ambos tienen la capacidad de ingresar al fruto mediante heridas en la superficie de la fruta o por secreción activa de enzimas. Comúnmente, se utilizan fungicidas químicos sintéticos para controlar este tipo de contaminación, lo que ha generado en la última década la aparición de cepas resistentes. El estudio de metabolitos secundarios (MS), obtenidos desde plantas, se vislumbra como una estrategia interesante de explorar para la generación de fungicidas naturales que suplan algunas de las desventajas de los fungicidas sintéticos, tales como la generación de resistencia en cepas de B. cinerea y P. italicum y presencia de residuos de estos en frutas en destino. Las saponinas corresponden a metabolitos secundarios de implicadas en la resistencia al ataque de patógenos, siendo abundantes en la cascarilla de quinua chilena (Chenopodium quinoa). En esta tesis se realizó la extracción de saponinas desde la cascarilla de quinua contemplando 4 etapas principales: (I) maceración, (II) precipitación de proteínas, (III) hidrólisis alcalina y (IV) ajuste de pH. Además, se evaluó el efecto de la temperatura (24 °C y 60 °C) en la etapa I, y el efecto de ausencia o presencia de la etapa III. El extracto 1 fue sometido a calentamiento (60°C) y a la etapa III, el extracto 2 fue sometido a calentamiento (60°C) en la etapa I, y el extracto 3 se mantuvo a 24°C. Finalmente, se evaluó la actividad antifúngica de tres extractos de quinua, enriquecidos en saponinas, sobre el crecimiento y germinación de Penicillium italicum y Botrytis cinerea. Además se estudió el mecanismo de acción que ejercen estos extractos contra el hongo. Los resultados muestran que el extracto 1 presenta una mayor cantidad de saponinas (48,5% peso seco) en comparación a los extractos 2 y 3. También, posee un efecto fungistático relevante en los hongos estudiados, disminuyendo el crecimiento micelial de ambos hongos. Además, los extractos 1, 2 y 3 producen una disminución en el porcentaje de germinación de B. cinerea y P. italicum, pero el efecto de éste último es más notorio. Se encontró que el extracto 1 aumenta la producción de ROS en P. italicum y causa daño en la membrana plasmática de ambos hongos. Los resultados anteriores sugieren que el extracto 1 podría ser utilizado en el desarrollo de algún fungistático.Ítem Dominios de la proteína Gc del virus andes (Hantavirus) : posibles herramientas para inhibir el proceso de fusión(Universidad Andrés Bello, 2009) Vidal Villanueva, Simón Eugenio; Tischler, Nicole,; Valenzuela, PabloLos virus con envoltura lipídica, como el virus Andes (genero Hantavirus), infectan células a través de la fusión de membranas virales y celulares. Dicha fusión es mediada por las glicoproteínas virales conocidas como proteínas de fusión. El proceso de fusión necesita de gatilladores apropiados para que la proteína fusogénica pueda interaccionar con su membrana blanco y posteriormente desencadenar la fusión. Existen al menos tres clases de proteínas de fusión distintas, dentro de las cuales la glicoproteína Ge de los virus Hanta ha sido clasificada en las de clase II. Las proteínas de fusión de clase II poseen tres dominios globulares compuestos mayoritariamente por estructuras de hoja beta. Al activarse, estas proteínas sufren un dramático cambio conformacional, el que consiste en el desplazamiento del dominio III hacia el péptido de fusión generando con esto la fusión de membranas. Para inhibir la actividad fusogénica de la proteína Ge del virus Andes, se sintetizó el dominio III (GcIII) y el dominio III con la región troncal (GcIII-St) en E. coli. Los cuerpos de inclusión de GcIII y GcIII-St fueron purificados y posteriormente solubilizados con agentes desnaturantes. Los dominios solubilizados fueron renaturados y las fracciones monoméricas de GcIII y GcIII-St fueron purificados mediante cromatografla de filtración en gel. La estructura secundaria de los dominios renaturados fue analizada mediante dicroismo circular. Finalmente, la actividad inhibitoria de GcIII, y anticuerpos anti Ge fue estudiada mediante un ensayo de fusión entre células. La actividad inhibitoria de GcIII fue de un 50 % en las condiciones ensayadas, con lo que se demuestra que la presencia del dominio III, podría ser utilizado para inhibir el proceso de fusión desarrollado por el virus.Ítem Análisis de la expresión global de genes asociados a crecimiento muscular en congrio colorado (Genypterus chilensis) bajo respuesta a estrés por manejo(Universidad Andrés Bello, 2014) Aedo Abadie, Jorge Eduardo.; Valdés, Juan Antonio.; Gallardo Escárate, Cristian.; Facultad de Ciencias Biológicas.; Escuela de Bioquímica.La diversificación de la acuicultura en Chile considera la incorporación de nuevos cultivos de peces que permitan posicionar a esta industria como uno de los sectores más importantes de la economía nacional. Dentro de los candidatos propuestos se encuentra el congrio colorado (Genypterus chilensis). Esta especie presenta un alto valor comercial en el mercado producto de la excepcional calidad de su carne blanca. Sin embargo, a pesar de las grandes cualidades que presenta, su proyección comercial se ha visto limitada producto de sus bajas tasas de crecimiento en cautiverio. Considerando que el tejido muscular representa alrededor de un 60% de la masa corporal de un pez, nuestro grupo se ha enfocado en estudiar y entender los mecanismos implicados en el crecimiento y desarrollo muscular en peces, así como también el estudio de variables intrínsecas o extrínsecas asociadas a estos procesos. Dentro de estas variables de encuentra el estrés causado por disturbios físicos relacionados a los métodos de cultivo tales como el manejo (handling stress). El estrés se puede definir como una condición en la cual el equilibrio dinámico de un organismo es perturbado como resultado de la acción de estímulos comúnmente definidos como estresores. A pesar de la extensa bibliografía sobre los efectos de agentes estresantes en el sistema neuro-inmune-endocrino de peces, muchos de los mecanismos moleculares por los cuales el estrés afecta el crecimiento muscular en peces se encuentran pobremente estudiados. Esto se debe principalmente a la falta de información genómica disponible de especies piscícolas. Considerando los antecedentes anteriormente descritos, en este trabajo proponemos como hipótesis que el efecto del estrés por manejo (Handling stress) induce cambios en la expresión global de genes asociados a crecimiento muscular de congrio colorado (G. chilensis) particularmente causando alteraciones en vías asociadas a atrofia muscular. Para verificar esta hipótesis, como primer objetivo se generó un transcriptoma de referencia secuenciado y anotado de G. chilensis mediante el uso de tecnologías de secuenciación masiva. Este comprende un total de 48.480 secuencias del cual un 44% presenta anotación funcional. Como segundo objetivo, se determinó la expresión diferencial de genes en músculo de G. chilensis bajo estrés. Para ello, se secuenciaron transcritos de G. chilensis sometidos a un protocolo de estrés por manejo para su posterior mapeo en el transcriptoma de referencia previamente generado. Un total de 1062 genes variaron su expresión bajo esta condición, dentro de los cuales se encuentran genes asociados a procesos catabólicos, traducción, diferenciación y proliferación celular. Finalmente, como tercer objetivo se validó la expresión diferencial obtenida in silico de ocho genes involucrados en crecimiento y diferenciación muscular por RT- gPCR. Los genes candidatos fueron: Factor de respuesta a daño de DNA (redd-1), Factor de unión a la proteína 4eiF4 (4ebp-1), foxo, atrogina-1 y subunidad 1 reguladora del proteosoma 26S (psdml), todos ellos involucrados en vías de atrofia muscular, junto con smad-2, myoDi y myoD2, los cuales están involucrados en procesos de diferenciación muscular. Todos los niveles de expresión obtenidos por RT-gPCR se correlacionan con los obtenidos por los análisis de RNAseq. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por manejo induce cambios en la expresión global de genes en músculo de G. chilensis, particularmente, encontrándose sobreexpresados genes claves que participan en vías de atrofia del músculo esquelético. Por último, el transcriptoma de referencia generado nos proporciona una fuente invaluable de información genómica de G. chilensis que puede ser utilizada para monitorear la expresión global de genes bajo diferentes condiciones de cultivo de esta importante especie de interés comercial.Ítem Generación de superóxido en plasticidad estructural vía NMDA-NR2B/RasGRF1[NOX2 en neuronas in vitro(Universidad Andrés Bello, 2015) Abarzúa Pastene, Sebastián Alejandro.; Zundert, Brigitte van; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica.La plasticidad neuronal es un término que define la capacidad de las neuronas para cambiar o reorganizar sus circuitos y funciones dependientes de actividad. Así, durante el desarrollo del cerebro la plasticidad estructural puede cambiar a través de un proceso denominado dendritogénesis. Es aceptado que este proceso incluye actividad sináptica mediada por el receptor N-metil D-aspartato (R-NMDA), un receptor ionotrópico que es activado por glutamato y que está compuesto típicamente por dos subunidades obligatorias NR1 y dos subunidades NR2A-D. Se ha demostrado que R-NMDA juega un rol fundamental en la organización estructural dependiente de actividad tanto in vivo como in vitro. Además, antecedentes de nuestro laboratorio señalan que la sobre expresión de la subunidad NR2B, y no NR2A, permite aumentar la arborización dendrítica en neuronas hipocampales (NHs) y neuronas de la médula espinal ventral (NMEVs), y que este aumento sólo es posible si el dominio C-terminal de NR2B está presente. De esta forma NR2B estaría modulando diferentes procesos celulares involucrados en plasticidad estructural. Además de la configuración del R-NMDAs, la asociación de éste con sus proteínas de anclaje o complejos de transducción de señales, también está involucrado en fenómenos de plasticidad. Por ejemplo, RasGRFI, uno de los factores intercambiadores del nucleótido guanina que facilita la liberación de GDP para unir GTP a la molécula efectora, se encuentra enriquecido en la sinapsis y ha sido descrito como regulador de la vía de señalización ERK1/2 dependiente de R-NMDA. La activación de RasGRFI se asocia también a un aumento de la dendritogénesis; esto es posible ya que posee un dominio de unión especifico a NR2B. Adicionalmente, está reportado que la estimulación del R-NMDA permite la generación de superóxido. En este contexto la enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa 2 (NOX2), es la principal fuente de superóxido (02) in vitro. No ha sido reportado cuál de las subunidades del R-NMDA, NRINR2B o NRINR2A, es la encargada de activar aNOX2, ni tampoco si el superóxido estaría modulando la dendritogénesis vía R-NMDANR2B/RasGRFl. Con el objetivo de evaluar la producción de superóxido se usó una sonda comercial que al ser oxidada específicamente por el superóxido emite una señal fluorescente. Para evaluar la importancia de la participación de las distintas subunidades del R-NMDA en la vía de señalización asociada a la producción de superóxido, se transfectaron NHs y en NMEVs con los constructos NR2B-BD y RasGRFl-BD. Finalmente se evaluó la contribución de la enzima NOX2 en la dinámica de dendritogénesis. Se encontró que los niveles de superóxido en las NHs varían durante su desarrollo. En neuronas en estadios de desarrollo intermedio (12 DIV) la producción de superóxido aumenta comparado con estadios maduros (18 -25 DIV). Esto mismo sucede al estimular el R-NMDA pero se observa sólo una disminución significativa en la producción de superóxido, cuando se utiliza el bloqueador de NOX2 a los 7 y 12 DIV. También encontramos que la interacción de NRINR2B con RasGRF1 es necesaria para la generación de superóxido a partir de NOX2. Además, al activar la vía NMDA-NR2B/RasGRFl y bloquear la NOX 2 con apocinina se genera la retracción de los procesos dendríticos, indicando que la generación de superóxido vía NMDA-NR2B/RasGRFl/NOX2 permite modular la dendritogénesis en NHs y NMEVs in vitro.Ítem Efecto del telurito (TeO3-2) sobre los complejos citocromo oxidasa bo y bd-I de Escherichia coli en condiciones aeróbicas(Universidad Andrés Bello, 2012) Abarca Lagunas, María José.; Sanhueza Acevedo, Ketty.; Facultad de Humanidades y Educación.La cadena transportadora de electrones (CTE) constituye una vía convergente de productos formados en la vía glicolitica y el ciclo de Krebs en E. coil. Aun cuando se sabe que el telurito afecta directamente estas vías, en relación con la CTE se ha observado una disminución en los niveles de ATP y cambios en el gradiente transmembrana (ApH), sugiriendo que probablemente podría ser otro de los blancos de este oxianión de teluro. Conocer los efectos del telurito sobre la CTE permitiría completar una visión global del funcionamiento del metabolismo central de E. coli en estas condiciones. Este trabajo de Tesis apuntó a estudiar el efecto que en particular ejerce el telurito sobre los complejos citocromo oxidasa bo y bd-I de E. coli en condiciones aeróbicas de crecimiento. Se encontró que la exposición de la bacteria a concentraciones subletales del tóxico genera un estado de estrés oxidativo que afecta el normal funcionamiento de la CTE, en que las oxidasas terminales disminuyen su actividad viéndose particularmente afectado el complejo citocromo bo. Se observó que la expresión de los genes que especifican el citocromo bo disminuye, sugiriendo que el telurito afectaría no sólo la actividad de este complejo, sino que además el nivel de sus transcritos. Como se esperaba, se observó además la inducción de genes involucrados en respuesta a estrés oxidativo. Sin embargo y dada la gran toxicidad del telurito, aparentemente la célula llevaría a cabo un drástico cambio orientándose a un metabolismo de tipo anaeróbico para así aliviar los efectos provocados por la exposición a telurito. Finalmente, se determinó que membranas de E. coil reducen telurito en una reacción dependiente de NADH que no es inhibida por KCN, poniendo en duda la participación de las oxidaras terminales.Ítem Propuesta de un programa de formación basado en competencias transversales en turismo sustentable para las asignaturas a impartir en centros de formación técnica del Estado(Universidad Andrés Bello, 2016) Mella Monsalve, Carolina; Rivas Ortega, Humberto; Facultad de Ciencias de la VidaEn marzo de 2016 se publicó la Ley Nº20.910 que "Crea quince Centros de Formación Técnica Estatales" que busca reforzar y mejorar la enseñanza técnico profesional superior, mediante la creación de 15 Centros de Formación Técnica Estatales. Esto se presenta como una oportunidad de intervención idónea, en pro de la creación de una oferta académica que responda a las necesidades de desarrollo económico productivo de cada región del país y logre la inserción real de sus egresados en el territorio en el que se forman. En este mismo sentido, reconocer las falencias y/o debilidades en la formación de los actuales egresados de carreras relacionadas al turismo, permitirá generar una propuesta que considere las temáticas poco abordadas o no consideradas en la actualidad y que incluyan una base de contenidos orientados al desarrollo competente y útil de sus egresados. De modo general, este proyecto se centra en 3 ejes: educación, sustentabilidad y capital humano egresado de carreras relacionadas al turismo en Chile. Se parte de la base que la educación es el principal agente de transformación hacia el desarrollo sustentable, ya que este camino es el que permite transmitir conocimientos y orientar entre otras cosas, las habilidades técnicas y sociales, como también las competencias para desarrollarse como un ser humano pleno en el que se vean concretados sus anhelos de vivir en un mundo más justo hoy y mañana.Ítem Efecto del oxígeno molecular sobre la expresión de genes de la biosíntesis de giberelinas en la rizobacteria bradyrhizobium japonicum, simbiote de la soya(2013) Méndez Tapia, Constanza Eugenia; Rojas Garrido, María Cecilia; Carú Marambio, Margarita; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaLa biosíntesis de fitohormonas, como giberelinas (GAs), por rizobacterias simbióticas podría formar parte de la interacción entre la bacteria y la planta hospedera. Particularmente Bradyrhizobium japonicum, simbionte de la soya (Glycine max.), presenta en su genoma un operón de genes involucrado en la biosíntesis de GAs, que incluye genes de diterpeno ciclasas (cps y ks), genes de monooxigenasas P450 (CYP 112, 114 y 117) y genes homólogos a los de ferredoxina (orf 3), prenil transferasa (orf 6) y reductasa (orf 4). El promotor presenta homología con promotores regulados anaeróbicamente, lo que sugiere que la tensión parcial de O2 sería un factor determinante en la expresión de estos genes. En esta Tesis se investigó la expresión de los genes que participan en la biosíntesis de GAs en cultivos líquidos aeróbicos y anaeróbicos de B. japonicum así como en bacteroides aislados desde nódulos de plantas de soya, tanto a nivel transcripcional como a nivel de las actividades enzimáticas. La actividad de oxidasas de GAs se ensayó administrando sustratos marcados con C e identificando los productos mediante cromatografia de gases acoplada a espectrometrfa de masa. Para los genes cps y ks se detectaron los mRNAs mediante RT-PCR. El sustrato de la oxidasa del carbono 20 (20ox), C-GA12, no fue transformado por los cultivos aeróbicos a diferencia de los cultivos anaeróbicos en los que se convirtió parcialmente a los productos C20 aldehído y el producto de oxidación del metilo 20 hasta CO2, 14C-GA9. Los bacteroides simbióticos presentaron una alta actividad de 20ox. En concordancia, se detectaron los mRNAs de cps y ks tanto en bacteroides simbióticos como en cultivos anaeróbicos, mientras que los cultivos aeróbicos no se detectaron transcritos de estos genes. La actividad de 20ox así como los mRNAs de cps y ks están presentes en bacteroides de plantas durante la etapa de floración lo que es consistente con la participación de las GAs bacterianas en la simbiosis. La metabolización de precursores tempranos de GAs demostró que el producto final de la secuencia biosintética en los bacteroides es GA9 y que no se sintetizan GAs hidroxiladas. La bacteria le entregaría a la planta este producto final, precursor de las GAs bioactivas como fitohormonas, el que podría ser posteriormente activado por hidroxilasas de la planta para participar en la etapa reproductiva de las plantas soya.Ítem Regulación, estructura y función de los genes iroquois en el pez cebra(Universidad Andrés Bello, 2004) Feijóo García, Carmen Gloria; Allende Connelly, Miguel; Gómez-Skarmeta, Jose Luis; Facultad de Ciencias de la VidaLos genes iroquois (irx) codifican homeo proteínas conservadas en la evolución con funciones similares durante el desarrollo del sistema nervioso de Drosophila melanogaster y de vertebrados (revisado en 7, 22). Tanto en Drosophila como en vertebrados los genes irx se organizan en el genoma de manera similar (5, 8, 19, 23, 37, 40, 41). Así, en Drosophila, los genes irx se organizan en un complejo, el complejo irx (C-Iro), que contiene tres genes, araucan (ara) , caupolicán (caup) y mirror (mirr) (8, 19). En mamíferos, existen dos complejos iro, IrxA que contiene los genes irxl, irx2, irx4, e IrxB que contiene los genes irx3, irx5 y irx6. (5, 40). Por otro lado, tanto en Drosophila como en vertebrados, los patrones de expresión de los genes iro dentro de un complejo son muy similares (19, 28). Más aún, los ortólogos de los diferentes genes irx en distintos vertebrados presentan dominios de expresión en territorios equivalentes (2, 5, 40). Por último, los genes irx en invertebrados y en vertebrados, al menos en parte, están regulados por las mismas vías de señalización (9, 19, 20, 21, 27). Los datos antes descritos sugieren la presencia de elementos reguladores comunes a más de un gene irx dentro de cada complejo y posiblemente conservados entre las diferentes especies. La identificación de estos elementos reguladores y posteriormente los factores de trascripción que se unen a ellos permitirá dilucidar en que vías de señalización participan los genes iroquois y con ello comprender mejor su función en el desarrollo embrionario. En este trabajo hemos determinado la existencia de elementos reguladores comunes muy conservados tanto en secuencia como en función entre humano, ratón pez cebra y pez fugu. Además, este análisis nos permitió identificar el territorio en el cual cada elemento regulador dirige la expresión de irx3a, en un determinado estadio del desarrollo del pez cebra. También hemos identificado la totalidad de los miembros de la familia de genes irx de pez cebra, la cual esta compuesta por 11 genes, además de su estructura genómica. Los genes irxla e irx2a, están ubicados en el complejo IrxBa; irxl b e irx4b en el complejo Irx.Ab; irx3a, irx5a, e, irx6a se ubican en el complejo IrxBa y finalmente irx3b e irx5b están ubicados en el complejo IrxBb. irx7 no pudo ser asignado a ningún complejo. Además hemos determinado el patrón de expresión espacial para irxl b, irx2a, irx-la e irx5b, y el patrón de expresión temporal para irx3b e irx4b. Con el fin de corroborar nuestros datos observados en el pez cebra, se analizó la estructura genómica de otro pez, el pez fugu (Takifugu rubripes), siendo ambas muy similares. En el pez fugu también existen 4 complejos, Aa, Ab, Ba, Bb, con un total 10 genes, el gen irx3b se perdió en este pez. Con los datos obtenidos de la estructura genómica de ambos peces se estableció una nueva nomenclatura para los genes irx en peces. Finalmente, se determinó que irxl b se expresa en el territorio correspondiente a la placadas craniales en estadio de tailbud y que una sus funciones temprana s es participar en la definición de este territorio, lo que hace en conjunto con BMP. Por medio de dos estrategias distintas se determinó que a medida que bajan los niveles de BMP, se amplía el territorio de expresión de irxl b y con ello el territorio correspondiente a las placadas craniales. Estos resultados sugieren que se requiere un fino balance entre las concentraciones de BMP e irxl b para el correcto posicionamiento en el embrión del territorio placodal.Ítem Análisis funcional y estructural de los sitios de unión de ligandos en quinasas dependiente de ADP del dominio arquea : (thermococcus litoralis y pyrococcus furiosus)(UNAB, 2009) Olate Lillo, Fernando Andrés; Guixé Leguia, Victoria; Facultad de Ciencias de la VidaDentro de la Superfamilía Riboquinasa existe un grupo de quinasas dependientes de ADP de organismos hipertermófilos, entre las que se encuentran las glucoquinasas provenientes de las arqueas Pyrococcus furiosus y Thermococcus litoralis. Estas glucoquinasas catalizan la fosforilación de glucosa usando ADP como dador del grupo fosforito. Ambas enzimas presentan características bioquímicas similares como la termoestabilidad, la especificidad por el sustrato y el pH óptimo. Sin embargo, existen diferencias estructurales entre ambas, ya que la enzima de T. litoralis es un monómero con una masa molecular de 52 KDa, mientras que la enzima de P. furiosus tiene una masa molecular nativa de aproximadamente de 93 KDa y está compuesta de dos subunidades idénticas de 47 KDa, un enlace disulfuro entre las Cys95 de cada uno de los monómeros estabilizaría la estructura dimérica. En este trabajo, las enzimas de ambos microorganismos se purificaron a homogeneidad y se caracterizaron cinética y estructuralmente. A través de cromatografía de exclusión molecular se determinó el estado de agregación de ambas enzimas, el que no cambia en presencia de glucosa, ADP ó DTT. Ambas enzimas utilizan ADP, CDP, glucosa y manosa como sustrato en forma significativa, en tanto que ninguna de ellas reconoce al A TP como sustrato. La eficiencia catalítica para ADP, CDP y glucosa es 2, 1,7 y 3 veces mayor para la enzima de P. furiosus, respectivamente. La unión de los ligandos se determinó a través de microcentrifugación, ya que ambas enzimas poseen 4 triptófanos, pero estos aminoácidos no censan la unión de ADP o glucosa lo que no hace variar la fluorescencia. Las constantes de disociación para ADP (Ko) fueron de 42 y 75 μM y para glucosa de 0,54 y 0,47 mM para las enzimas de T. litoralis y P. furiosus respectivamente. Para la enzima de P. furiosus la constante de disociación para glucosa sólo se pudo determinar en presencia de AMP. Los resultados sugieren que ambas enzimas reconocen tanto purinas como pirimidinas y que la cantidad de grupos fosfatos es fundamental en el reconocimiento de este ligando. Además, de los experimentos de unión se predice un mecanismo de unión de sustratos de tipo ordenado para la ADP-GK de P. furiosus. Una de las explicaciones para la presencia de glucoquinasa dependiente de ADP es que el ADP muestra una mayor termoestabilidad que ATP, especialmente en la presencia de cationes divalentes. Otra explicación es que las reacciones anabólicas generan ADP, lo cual provee el sustrato para las quinasas dependiente de ADP, lo que permite la utilización de la glucosa en condiciones de baja carga de energía. Desde el punto de vista evolutivo, es importante el estudio comparativo de las propiedades funcionales y estructurales del sitio de unión del nucleótido a nivel de la superfamilia, porque permitirá definir si las propiedades que determinan la especificidad por el nucleótido son comunes entre las quinasas dependientes de ADP y las dependientes de ATP.Ítem Enredos por plástico del lobo fino en isla Guafo : ¿un impacto local en una isla prístina?(UNAB, 2016) Pérez Venegas, Diego Joaquín; Ibañez, Chistián; Héctor Pavéz; Galbán-Malagón, Cristóbal; Facultad de Ciencias de la VidaLa contaminación por plásticos es un problema en aumento a nivel mundial siendo este alrededor del 60% del total de la basura marina, con tendencia al alza. Esta situación causa mortalidad de poblaciones de vertebrados marinos tanto por la ingesta como por el enredo con estos. A nivel mundial, la mortalidad por enredos es más alta que la por ingesta, registrándose a las aves y mamíferos marinos como las especies más afectadas. Sin embargo, aún no se ha determinado el verdadero impacto de esta problemática; o sus consecuencias sobre la dinámica poblacional de estas poblaciones naturales. El presente trabajo pretende evaluar el efecto que la mortalidad por enredos genera sobre la dinámica poblacional del lobo tino austral (Arctocephalus australis austra/is) de Isla Guafo (43°59'30"S 74°71 '34 " 00). Para ello se cuantificó los tipos de basura marina que vara en la zona, el número de enredos y su impacto tanto en los individuos como en las poblaciones.; durante las temporadas reproductivas de 2013-14 a 2015-16. Finalmente, se generó una tabla de vida para evaluar el efecto del retiro de individuos por enredos sobre la dinámica poblacional. Se determinó la presencia constante de basura (mayoritariamente plásticos) en la lobera, junto con enredos repetidos con restos de artes de pesca durante las temporadas de verano entre 2013 a 2016. El origen de los plásticos se relaciona con la actividad pesquera local. Aunque en 2006-07 se observaron muertes de cachorros por estrangulamiento, tras realizar análisis con tablas de vida no se pudo detenninar como un problema inminente a esta población. Con retiro de individuos por enredos muy bajos para generar cambios en la dinámica poblacional (<1%de la población). Sin embargo, se demostró, mediante modelos poblacionales que si lamortalidad por enredo sobrepasa el 10% de la población esto afecta negativamente la tasa intrínseca de crecimiento y con ello la dinámica de esta población. Siendo Isla Guafo un ecosistema único y "prístino" y alejada de intervención antrópica constante, se hace vital el conocer el potencial efecto de la contaminación por plásticos sobre una de sus poblaciones. Permitiendo usar al lobo fino austral como una potencial especie "paraguas" para la conservación de esta isla. Por ello se debe continuar un monitoreo constante en la zona, además de generar más estudios a largo plazo y mayor escala; utilizando las técnicas sugeridas en este trabajo para evaluar el real impacto de los enredos en las poblaciones de pinnípedos.Ítem Role of Clostridioides difficile spore surface proteins and toxins in spore interaction with the intestinal mucosa and recurrence of the disease(Universidad Andrés Bello, 2020) Castro Córdova, Pablo Andrés; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias de la VidaRecurrence of Clostridioides diffici/e infections (R-CDI) occurs in ~20% of successfully treated patients, representing a major clinical challenge due to the increasing severity and mortality rates after subsequent R-CDI episodes. C. difficile infection (CDI) is considered a nosocomial infection. Antibiotics use is the main risk factor. C. difficile produces spores that are crucial for transmission and R-CDI, and toxins that generate the clinical symptoms. Understanding the molecular and cellular mechanisms used by C. diffici/e spores to cause R-CDI is critica! to the design of therapies. We recently showed that C. difficile spores internalize into intestinal epithelial cells in the presence of fibronectin (Fn) and vitronectin (Vn). Besides, administration of drugs that inhibit spore entry in vitro to an R-CDI animal model showed to reduce the R-CDI rates. This work aimed to identify C. difficile spore exosporium proteins involved in the spore interaction with the intestinal mucosa and evaluate its role in R-CDI, also identify the role of C. difficile toxins TcdA and TcdB in the spore interaction with intestinal epithelial cells in vitro and in vivo and to test the use of FDA-approved drugs in the inhibition of spore interaction with the intestinal mucosa. We used confocal image analysis of intestinal mucosa using a ligated ileal/colonic loop mouse model to accomplish this aim. We showed that the insertional mutants of C. difficile spores for morphogenic spore factors CdeC (cdeC) and perhaps CdeM (cdeM) exhibited reduced adherence to the intestinal mucosa. Afterward, using animal models of R-CDI, we observed that cdeC but not cdeM mutant spores shown an increased severity during R CDI. Using the intestinal ligated loop model, we observed that bc/A3 isogenic mutant exhibited a reduced adherence in the intestinal mucosa. Also, by confocal microscopy, we showed that C. diffici/e toxins TcdA and TcdB produce a rearrangement of the ileum mucosa, increasing the luminal accessibility of the proteins required for the entry of C. difficile spores, such as Fn, Vn, and the integrins as and av. Besides, TcdA and TcdB increase the secretion of Fn and Vn, that bind to C. diffici/e spores. These toxins also contribute to spore adherence and internalization to intestinal epithelial cells. On the other hand, we observed that TcdB alone produces a rearrangement of the ileum mucosa that affects the accessibility of Fn and Vn and favors spore interaction with the intestinal mucosa. However, blocking TcdB with bezlotoxumab tends to decrease the spore adherence in the ileum mucosa. Finally, we tested the therapeutic potential of the FDA-approved nonsteroidal anti-inflammatory drug, indomethacin in a R-CDI animal model. Unexpectedly, we observed that indomethacin increases CDI severity. Also, we tested the FDA-approved antifungal nystatin and we observed that tends to reduce the spore interaction with the intestinal mucosa. These findings give additional knowledge for the design of novel therapies that consider the importance of the spore interaction with the intestinal mucosa during C. diffici/e infection treatment. Our results provide new insight for nystatin as an inhibitor of spore interaction with the intestinal mucosa with potential to reduce the R-CDI rates.Ítem Rol del sistema de dos componentes ArcAB en la supervivencia de Salmonella Typhimurium a las condiciones ambientales encontradas dentro de macrófagos, neutrófilos y en la evasión de la respuesta inmune adaptativa(Universidad Andrés Bello, 2019) Pardo Esté, Coral; Saavedra, Claudia; Pacheco, Rodrigo; Facultad de Ciencias de la VidaDurante su ciclo infectivo los patógenos utilizan varias estrategias que le permiten adaptarse a las diferentes condiciones a las que se enfrentan durante su ciclo infectivo dentro del hospedero. En este contexto, el sistema de dos componentes ArcAB es uno de los mecanismos que posee el patógeno bacteriano Salmone!la enterica serovar Typhimurium para responder de forma eficiente a condiciones cambiantes de oxígeno, lo que le permite a la bacteria adaptarse de manera eficaz. Particularmente, en esta investigación nos propusimos evaluar la participación que tiene ArcAB en la capacidad de supervivencia de la bacteria al ambiente intracelular, específicamente frente a Especies Reactivas de Oxígeno (ROS), así como también en la evasión de la respuesta inmune adaptativa. Para esto, se determinaron las condiciones asociadas a la presencia de ROS en las que la bacteria se encuentra dentro de los fagocitos. Posteriormente, evaluamos la intensidad del daño oxidativo intracelular, el cual está relacionado con la presencia del gen que codifica para el factor transcripcional ArcA en el genoma de la bacteria, así como también en la activación de la enzima mieloperoxidasa, la cual es la principal responsable de la producción de ROS dentro de los neutrófilos. Del mismo modo, determinamos que el factor transcripcional ArcA participa activamente en la modulación de la respuesta a nivel transcripcional de Salmone!la en la vacuola fagocítica. También encontramos que ArcA está involucrado en la defensa contra el daño oxidativo dado que regula genes claves que están relacionados con la virulencia y el metabolismo bacteriano, que son indispensables para la supervivencia de la bacteria. Por lo tanto, en conjunto estos resultados nos permiten afirmar que el sistema de dos componentes ArcAB es necesario para que Salmone!la Typhimurium sobreviva dentro de fagocitos como macrófagos y neutrófilos, a través de la modulación de su expresión génica eficiente frente a ROS. Así, estos resultados muestran el potencial que tiene ArcA como candidata para su utilización biotecnológica en la industria de producción de alimentos y la medicina aplicada. La utilización de cepas atenuadas de Salmone!la puede usarse como modelo para la generación de vacunas contra salmonelosis, una enfermedad con alta prevalencia en países en vías de desarrollo. Además, estas cepas también tienen el potencial de ser utilizadas como carriers en terapia sitio dirigida, en enfermedades crónicas o cáncer donde es necesario llevar moléculas a lugares específicos dentro del organismo.Ítem Regulación de la activación de las células dendríticas convencionales por el sensor de la respuesta a proteínas mal plegadas IRE1(Universidad Andrés Bello, 2022) Medel Fernández, Bernardita; Osorio Olivares, Fabiola; Facultad de Ciencias de la VidaLas células dendríticas (Dendritic Ce/Is, DCs) son células del sistema inmune necesarias para iniciar y dirigir la respuesta inmune adaptativa. La eficiencia con que estas células activan y controlan la función de los linfocitos T las ha convertido en un objetivo de estudio importante para el desarrollo de inmunoterapias contra diversas patologías. Es por esto que existe un interés especial en conocer los mecanismos intracelulares que controlan la homeostasis y función de las DCs. Uno de estos mecanismos corresponde al sensor de la respuesta a proteínas mal plegadas IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1) el cual ha demostrado regular procesos clave en la respuesta inmune. Este sensor actúa a través de su dominio RNasa mediando el splicíng alternativo del factor de transcripción XBP1s, y también degradando de manera regulada otros mRNAs en un proceso llamado RIDD (Regu!ated IRE1a Dependent mRNA Decay). De manera interesante, se ha descrito que IRE1 tiene un rol crucial en la biología de las cDC1, sin embargo, se desconoce la relevancia de este sensor en los diversos aspectos relacionados con la activación de las cDCls y su funcionalidad. En esta tesis doctoral determinamos la relevancia de IRE1 en el proceso de activación de las cDCls, específicamente en el reconocimiento innato, sobrevida, presentación antigénica y migración de estas células. Utilizando ratones knock out condicionales para IRE1 o XBP1 específicamente en DCs, y el cultivo de DCs derivadas de médulas ósea "Notch-cDCs", determinamos que las Notch-cDCls pueden adquirir dos estados de activación: activación homeostática ( en ausencia de ligandos de receptores de reconocimiento de patrón, PRR) y la activación canónica (en presencia de ligandos de PRR). La activación homeostática depende de XBP1s para la producción de moléculas coestimulatorias y de RIDD para la producción de IL-12p40, siendo importante para la activación de linfocitos T específicos in vivo. Por otro lado, XBP1 y RIDD controlan la producción de citoquinas proinflamatorias en respuesta a Poly I:C como activador canónico de las DCs. En resumen, nuestros resultados posicionan a IRE1 como un regulador emergente de la activación en las cDC1.Ítem Participación de los sistemas Toxina-Antitoxina de Tipo II y proteasas Clp de C/ostridioides difficile R20291 en la generación de células persistentes y en fenotipos virulentos(Universidad Andrés Bello, 2020) Álvarez Espinosa, Ricardo Hernán; Gil Michell, Fernando Rafael; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias de la VidaEn las últimas décadas, se ha evidenciado un aumento en la frecuencia de patógenos bacterianos que tiene multirresistencia a fármacos y tolerancia a antibióticos. Los mecanismos clásicos de resistencia a antibióticos en patógenos bacterianos son generalmente causados por mutaciones o adquisición de genes de resistencia. Por el contrario, los mecanismos de tolerancia implican la aparición de células persistentes, las cuales son variantes fenotípicas de bacterias silvestres que contribuyen a la persistencia bacteriana en el hospedero. Estas células se generan principalmente frente a un ambiente estresante, pero también pueden generarse de forma estocástica. El mecanismo por el cual se forman ha sido difícil de dilucidar debido a que solo una pequeña fracción de la población se vuelve persistente, pero un factor común son las toxinas de los sistemas toxina-antitoxina (TA) y las proteasas Lon y Clp. Los sistemas TA están compuestos por dos genes, los que codifican para una toxina y su antitoxina afín. En condiciones normales de crecimiento, la antitoxir.a se forma un complejo con la toxina, lo que evita que esta última ejerza su efecto. Mientras que, frente al estrés ambiental causado por los antibióticos, se genera una baja en los niveles de la antitoxina, debido a su degradación por proteasas propias de la bacteria (Lon y Clp), produciéndose la liberación y activación de la toxina, lo que llevará a la inhibición del crecimiento y, por lo tanto, a la generación de células persistentes. Los sistemas TA han sido relacionados con la persistencia bacteriana en muchos patógenos bacterianos. Sin embargo, tanto la persistencia como la contribución de los sistemas TA de Tipo II y las proteasas Lon y Clp, no han sido estudiados en el patógeno nosocomial Clostridioides difficile. Este patógeno es el agente etiológico de las infecciones causadas por C. difficile, las cuales son responsables del 30% de las diarreas infecciosas asociadas al uso de antibióticos. Además, tiene gran capacidad de persistir en el hospedero, lo que contribuye a la alta tasa de infecciones recurrentes. En este trabajo determinamos que C. difficile forma células persistentes frente al tratamiento con antibióticos in vitro. Además, C. difficile R20291 posee 9 sistemas TA de Tipo II hipotéticos, de los cuales RelBE y MazEF son funcionales, poseen actividad endorribonucleasa y aumentan su expresión frente a vancomicina, la que es dependiente de la proteasa ClpP2 y la chaperona ClpC. Finalmente, ClpP2 y ClpC participan en formación de células persistentes, en la generación de biopelículas, motilidad, producción de toxinas, esporulación y adherencia a células epiteliales. Estos resultados sugieren que ClpP2 y ClpC contribuyen a la virulencia de C. diffici/e R20291.