Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado
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Ítem Caracterización de los componentes de la pared celular de uva de mesa "Thompson Seedless" en estadios tempranos de desarrollo y su relación con la firmeza en cosecha y postcosecha(Universidad Andrés Bello, 2019) Gutiérrez Ferreira, Carlos Germán; Campos Vargas, Reinaldo; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaVitis vinifera es una de las especies de plantas frutales más importantes en el mundo. La uva de mesa es la fruta fresca más exportada en Chile, siendo la variedad Thompson Seedless una de las más relevantes dentro de los múltiples cultivares producidos en nuestro país. La exportación de este producto a los mercados extranjeros conlleva grandes desafíos debido a las distancias y por consecuencia, al tiempo de transporte involucrado, el cual afecta directamente su calidad debido a los distintos procesos metabólicos que permanecen activos, aún incluso durante su almacenamiento en frío. Uno de los atributos más afectado corresponde a la firmeza de la baya, el cual es uno de los parámetros más apreciados por el consumidor, no obstante, la variedad Thompson Seedless presenta problemas para mantener estas características durante postcosecha. Esta disminución en la firmeza se ha asociado al desensamble de la pared celular en diversos tipos de berries, sin embargo, los antecedentes disponibles no consideran las modificaciones que presenta esta estructura durante los puntos previos a pinta. En el presente estudio se sugiere que los distintos componentes de la pared celular se encuentran asociados a la firmeza del fruto y deben ser analizados en su conjunto debido a las grandes variaciones fenotípicas y moleculares que presenta la uva de mesa durante todo su desarrollo. Nuestros resultados sugieren que la disminución de textura en las bayas se encuentra directamente asociada al aumento del epítopo disponible, correspondiente a las ramificaciones del ramnogalacturonano I y a la configuración XXXG presente en las cadenas de hemicelulosa, observado mediante un análisis inmunologico in muro. Los análisis enzimáticos en la totalidad del fruto muestran una elevada actividad de las enzimas (3-Galactosidasa y Poligalacturonasa encargadas del remodelamiento de la pared, principalmente en los estadios tempranos del desarrollo; observando una correlación entre esta actividad y la expresión de los genes correspondientes a estas enzimas durante las primeras semanas post-antesis del fruto. Nuestros resultados sugieren que el ablandamiento se debe a la degradación de los distintos componentes de la pared celular, donde el aumento de pectinas y hemicelulosas en las fases solubles del fraccionamiento de la pared presenta la mayor correlación con el parámetro de firmeza durante la cosecha del fruto.Ítem Efecto de la hipotiroxinemia gestacional sobre la integridad de la barrera intestinal de la progenie(Universidad Andrés Bello, 2018) Gutiérrez González, Barbara Cecilia; Riedel S., Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa hipotiroxinemia (HTX) es una condición que se caracteriza por la disminución de los niveles plasmáticos de 3,5,3'5'-L-tetra-yodo-tironina (T4) mientras que los niveles plasmáticos de 3,4,3'-L-tri-yodo-tironina (T3) y de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) permanecen normales. La HTX gestacional es dañina en el feto puesto que genera una impronta irreversible en el feto. Las hormonas tiroideas (HT) tienen un importante rol en el desarrollo intestinal y en la mantención de la homeostasis intestinal ya que estimulan la proliferación de células madres y células epiteliales del intestino. Además, las HT participan del recambio de las células epiteliales intestinales durante toda la vida. Debido a que las células epiteliales intestinales forman la barrera intestinal, la cual es la encargada de permitir y bloquear el paso de moléculas al organismo, es posible que la progenie gestada en HTX tenga alterada la permeabilidad intestinal. En base a estas evidencias se propone la siguiente hipótesis de trabajo: "La hipotiroxinemia gestacional aumenta la permeabilidad intestinal y la inflamación del intestino de la progenie" Para evaluar esta hipótesis propusimos los siguientes objetivos específicos: 1) Evaluar la permeabilidad intestinal de la progenie gestada en hipotiroxinemia; 2) Evaluar la histología intestinal y moléculas relacionadas con inflamación en el intestino de la progenie gestada en hipotiroxinemia. Para llevar a cabo estos objetivos se realizaron ensayos de permeabilidad in vivo utilizando FitCdextrano y HRP y ex vivo utilizando FSA y HRP. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo de la permeabilidad paracelular a nivel del íleon de la progenie gestada en HTX. El análisis histológico de cortes de íleon teñidos con hematoxilina y eosina mostró mayor infiltrado celular, una mucosa más ensanchada y una submucosa más delgada en la progenie gestada HTX. Patrones similares a un cuadro de inflamación intestinal. Se observó aumento en la expresión del RNA mensajero para HO1 y disminución para el RNA mensajero de NQO 1. Mientras que no se observaron diferencias significativas para los RNA mensajeros ni la proteína de TNFa, INFy e IL-10. El análisis del contenido de proteínas que componen a las uniones estrechas como son ZO-1 y Ocludina mostró que el contenido de ZO-1 en el íleon está disminuido en la progenie gestada en HTX en comparación a la progenie control. Mientras el contenido de ocludina es similar en ambas progenies. Los resultados obtenidos en esta tesis apoyan la hipótesis de que la HTX gestacional imprime en la progenie mayor permeabilidad en la barrera intestinal del ileón. Además, los resultados del análisis histológico de esta tesis sugieren que el ileum de la progenie gestada en HTX presenta un estado inflamatorio basal. Este estado inflamatorio y la mayor permeabilidad de la barrera intestinal del ileum en la progenie gestada en HTX podría ser un factor que contribuyese al desarrollo de patologías como mal de Crohn, enfermedad celiaca o enfermedades del SNC asociadas a mayor permeabilidad intestinal como Parkinson y esquizofrenia.Ítem Rol del sistema de dos componentes BaeSR de Salmonella Typhimurium en la modulación de la expresión de las superóxido dismutasas frente a ciprofloxacino(Universidad Andrés Bello, 2013) Guerrero Escudero, Patricio Juan José; Gil Michell, Fernando Rafael; Saavedra Sánchez, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaDurante su ciclo infectivo, Salmonella Typhimurium (S Typhimurium) debe adaptarse a diversos cambios medioambientales. Para ello, debe detectar y responder a las diferentes señales y condiciones a las que se ve enfrentada. Dentro de los mecanismos utilizados por S. Typhimurium y otras bacterias, se encuentran los sistemas de dos componentes (SDC), que consisten de una proteína localizada en la membrana interna y que actúa como un "sensor", y un factor transcripcional localizado en el citoplasma denominado "regulador de respuesta". Los SDC responden a diversas señales, incluyendo cambios en el pH, osmolaridad, antibióticos, etc, entre otras. En este contexto, ha sido reportado que el SDC BaeSR participa en la respuesta a ciprofloxacino (CIP), un antibiótico cuyo mecanismo de acción incluye la producción de la especie reactiva de oxígeno superóxido (Oz ). Para evitar el daño producido por esta molécula oxidante, el genoma de S. Typhimurium codifica tres isoformas de la enzima superóxido dismutasa (SOD), SodA, SodB y SodC, cuya función es la degradación de O . Dado que el SDC BaeSR responde a CIP y que este antibiótico genera OZ , se realizó un análisis in sulco de los promotores de sodA y soda en busca de posibles sitios de unión del regulador BaeR. El análisis predijo la presencia de dos sitios de unión de BaeR en el promotor de sodA (BBS 1 y BBS2), y uno en el promotor de soda (BBS). En base a estos antecedentes, se buscó establecer si el SDC BaeSR activa la expresión de sodA y sodB en respuesta a CIP. Los resultados de esta Tesis demuestran que el SDC BaeSR activa la expresión de sodA en respuesta a CIP a través de una interacción directa con el sitio BBS 1, que esta activación es independiente del regulador SoxS, y que BaeSR es requerido para mantener los niveles basales de soda a través de un mecanismo no identificado.Ítem Análisis de la función del ligando Wnt5a sobre la diferenciación y desarrollo de nuevas neuronas generadas a partir de progenitores hipocampales adultos(Universidad Andrés Bello, 2017) Guerrero Gómez, Fernanda Isabel; Varela-Nallar, Lorena; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa neurogénesis es el proceso de generación de nuevas neuronas en el cerebro adulto. Este proceso toma lugar en la zona sub granular (SGZ) en el giro dentado (DG) del hipocampo y en la zona sub ventricular (SVZ) en la pared de los ventrículos laterales. Las células madres neuronales también llamados progenitores hipocampales adultos (AHPs) están presentes en la SGZ proliferan y dan paso a neuronas granulares. Éstas células migran a través de la capa de células granulares (GCL), extendiendo sus dendritas hacia la capa molecular (ML) integrándose al circuito hipocampal contribuyendo al aprendizaje y la memoria dependiente del hipocampo. Los AHPs pueden ser aislados del cerebro adulto y ser estudiadas in vitro. Entre varios mecanismos que modulan la neurogénesis, poco se sabe sobre el rol específico que tienen las vías de señalización Wnt no canónicas. Como la vía wnt no canónica participa en el desarrollo morfológico y la diferenciación de las neuronas en las etapas embrionarias nosotros proponemos que podría regular los mismos procesos en la neurogénesis adulta.Wnt5a, es un ligando Wnt no canónico que se ha visto involucrado en la regulación de la diferenciación y desarrollo morfológico neuronal en estadios embrionarios. Con esto, nosotros proponemos que el ligando Wnt5a regula la diferenciación y desarrollo morfológico de las nuevas neuronas generadas a partir de AHPs. El objetivo es estudiar la función del ligando Wnt5a sobre la neurogénesis hipocampal adulta in vitro e in vivo, utilizando ligando recombinante Wnt5a obtuvimos un aumento en la proliferación de los AHPs in vitro. Utilizando un vector lentiviral que expresa un shENA contra el ligando Wnt5a (shWnt5a), se redujo la expresión de Wnt5a en AHPs y en hipocampo de ratón. Determinamos que el shWnt5a disminuye la diferenciación y desarrollo morfológico en neuronas generadas a partir de AHPs sugiriendo que participaría en la regulación neurogénesis adulta.Ítem Estudio de la interacción del factor de transcripción bZIP 17 con el coactivador NPR 1 en respuesta a estrés salino en Arabidopsis thaliana(Universidad Andrés Bello, 2013) Greve Muñoz, Macarena; Orellana López, Ariel; Blanco Herrera, María Francisca; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa respuesta a estrés salino es mediada por la activación de factores de transcripción del tipo bZIP, como bZIP 17, el que juega un rol en la activación transcripcional de genes de respuesta a estrés salino. Esta proteína presenta una alta similitud con el factor de transcripción TGAlb de Tabaco, proteína que interactúa con el coactivador NPR1, para activación transcripcional de genes de defensa. Esta proteína es regulada por desbalance redox intracelular, gatillado en condiciones de defensa contra patógenos, todo esto mediado por la fitohormona ácido salicílico (SA). Utilizando plantas transgénicas que expresan NPR1 fusionado con GFP, se observó que NPR1 es translocado al núcleo en condiciones de estrés salino, y, por otro lado, se demostró que ambas proteínas estarían interactuando mediante la técnica de BiFC. Adicionalmente, los genotipos bzipl7-1, nprl-1 y nprl1/35S:NPR1-GFP presentan fenotipos susceptibles en presencia de estrés salino, de tipo crónico y agudo. Por otro lado, el (SA) esta involucrado en la respuesta a estrés salino, ya que la exposición de plantas a NaCl en presencia de bajas concentraciones de SA, presentan una mejor sobrevivencia. Ensayos de germinación de semillas en presencia de concentraciones bajas de SA, expuestas a estrés salino, presentan una mayor taza de sobrevivencia, comparado con las lineas mutantes. Mediante análisis de qRT-PCR se identificó que en las líneas en estudio los niveles de expresión de genes de respuesta a estrés salino, que son dependientes de bZIP 17, es menor en comparación al control. Estos resultados sugieren que ambas proteínas podrían estar siendo claves en la respuesta a estrés salino en Arabidopsis thaliana, siendo necesaria la presencia de SA intracelular para la adaptación de la planta frente a estrés salino.Ítem Impacto de la deficiencia de hormonas tiroideas maternas en la gestación, sobre el proceso de astrogliosis reactiva frente a inflamación en la progenie(Universidad Andrés Bello, 2013) González Figueroa, Pablo Andrés; Riedel S., Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa deficiencia de hormonas tiroideas maternas en la gestación, tanto el hipotiroidismo como la hipotiroxinemia, daña irreversiblemente el sistema nervioso central del feto (SNC). Especificamente se ha observado daño en la maduración y diferenciación tanto de las neuronas como de las células gliales. Entre las células gliales se encuentran los astrocitos, células que cumplen diversas funciones en el SNC. Una de las funciones de los astrocitos es la astrogliosis reactiva frente a una respuesta inflamatoria. La astrogliosis se caracteriza por aumento del tamaño del astrocito, del número de sus proyecciones y de su proliferación. Las evidencias indican que la astrogliosis es un proceso de protección frente al daño inflamatorio. La astrogliosis reactiva sea descrito en enfermedades como la esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad autoinmune al SNC cuya etiología es desconocida, multifactorial y con una incidencia alta a nivel mundial. La EM se caracteriza por presentar desmielinización y degeneración neuronal, consecuentemente la pérdida de la actividad motora y cognitiva del paciente. La EM se estudia en gran medida en un modelo experimental de animales llamado encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Evidencias de nuestro laboratorio han mostrado que animales gestados bajo la deficiencia de hormonas tiroideas sufren de EAE más severo que los animales gestados en condiciones eutiroideas. Basados en los antecedentes descritos anteriormente, sobre el rol de las hormonas tiroideas en la diferenciación de los astrocitos proponemos las siguiente hipótesis: "La astrogliosis reactiva generada en procesos inflamatorios, se encuentra disminuida en astrocitos provenientes de la progenie gestada con déficit de hormonas tiroideas tanto como el hipotiroidismo o la hipotiroxinemia". Con el objetivo de responder a esta hipótesis evaluamos la astrogliosis en animales que sufren EAE y que se gestaron en madres con hipotiroidismo. Además estudiamos el rol de factor tumoral de necrosis a (TNFa), molécula clave en el desarrollo de EAE, sobre la astrogliosis reactiva en un modelo in vitro de astrocitos provenientes de ratas gestadas en hipotiroxinemia. Los resultados obtenidos en esta tesis, muestran que el hipotiroidismo gestacional produce astrogliosis reactiva sólo en regiones específicas del SNC en que padecen EAE., Los resultados del estudio in vitro mostraron una mayor expresión de ¡NOS principal molécula inflamatoria involucrada en el daño durante la EM. En conclusión, nuestros resultados indican que la deficiencia de hormonas tiroideas durante la gestación genera una impronta en los astrocitos, haciéndolos más inflamatorios pero disminuyendo su capacidad de astrogliosis reactiva.Ítem Expresión del RNA mitocondrial no codificante sentido 2 (SncmtRNA-2) durante la transformación celular asociado a infección del virus del papiloma humano (HPV)(Universidad Andrés Bello, 2013) González Chacón, Paulina Andrea; Villota Arcos, Claudio Enrique; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaEl 99% de los casos de cáncer cervicouterino está dado por infecciones persistentes con el Virus del Papiloma Humano (HPV). Hemos reportado previamente una familia de RNAs mitocondriales no codificantes (ncmtRNAs) que son expresados diferencialmente de acuerdo al tipo celular. Células normales en proliferación expresan un transcrito sentido (SncmtRNA-1) y dos transcritos antisentido (ASncmtRNA-1 y 2). Por otra parte, células tumorales expresan el SncmtRNA-1 pero reprimen la expresión de los ASncmtRNAs. Utilizando la infección por HPV como un modelo de transformación celular, encontramos que queratinocitos inmortalizados con HPV-16/18 expresan un nuevo transcrito sentido denominado SncmtRNA-2, el cual se expresa en muy bajos niveles en células normales o transformadas por HPV. En el presente trabajo, hipotetizamos que el proceso de inmortalizacióntransformación celular depende de los niveles de expresión del SncmtRNA-2. Para probar esta hipótesis, células inmortalizadas con HPV-16/18 fueron transducidas con un vector lentiviral que codifica para ras para inducir la transformación celular definitiva. La sobreexpresión de RAS indujo características tumorales en células inmortalizadas con HPV-18, tales como una mayor tasa de proliferación, capacidad de migración-invasión y propiedades clonogénicas. Aún más, las células inmortalizadas con HPV-18 que sobre-expresan RAS bajaron la expresión del SncmtRNA-2, tal como previamente fue observado en HeLa, Silla y Caski (células transformadas por HPV). Por otro lado, células inmortalizadas con HPV16 que sobre-expresan RAS mostraron una alta tasa proliferativa y una moderada capacidad de migración, pero no adquirieron propiedades clonogénicas. Interesantemente, estas células no reprimieron la expresión del SncmtRNA-2. Los resultados descritos aquí sugieren fuertemente que el SncmtRNA-2 podría estar implicado en mantener el estadio pre-tumoral, aunque se requieren futuros estudios para comprender completamente la función de estas moléculas.Ítem Efecto de ácidos biliares en atrofia de músculo esquelético y su regulación mediante la vía de señalización ERK en un modelo de miotubos in vitro(Universidad Andrés Bello, 2020) González Wistuba, Francisco Javier; Cabello-Verrugio, Claudio; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaLa atrofia del músculo esquelético se puede definir como la pérdida de masa muscular y, por lo tanto, la pérdida de función del músculo. Los principales factores que causan esta condición patológica son el envejecimiento, el desuso, la denervación y las enfermedades crónicas, en cuyo caso la patología se denomina caquexia. Dentro de las enfermedades crónicas asociadas a patologías musculares se encuentra la enfermedad hepática crónica (EHC) en la cual la caquexia es una de las complicaciones más comunes ya que está presente aproximadamente en un 40-70% de los pacientes con EHC y que además afecta de manera adversa la supervivencia, calidad de vida y los resultados después de un trasplante de hígado. Pero, a pesar de su relevancia, es una de las complicaciones con pocos estudios en EHC y que actualmente no presenta terapias efectivas como tratamiento. Estudios previos muestran que en un modelo de EHC se observa desarrollo de atrofia, y además un aumento característico de ácidos biliares, presente también en pacientes con EHC. Se ha reportado que en otros tejidos el receptor de ácidos biliares TGR-5 (presente también en músculo), activa las vías de señalización ERK y JNK y que, además, en otro modelo de atrofia, ambas señalizaciones participarían en la pérdida muscular. En esta tesis se planteó que los ácidos biliares cólico (CA) y desoxicólico (DCA) producen una condición atrófica muscular a través de la activación de las vías ERK y JNK, para lo cual se utilizó un modelo de miotubos in vitro. Nuestros resultados indican que ambos ácidos biliares inducen efectos atróficos como la disminución de proteínas miofibrilares y del diámetro de miotubos. Además, se comprobó que DCA induce fosforilación de ERK, mientras que CA fosforila ERK y JNK lo que sugiere la activación de estas vías. Posteriormente mediante inhibición farmacológica se comprobó que solo ERK participaría en el efecto atrófico mediado por ácidos biliares ya que se revierte la disminución de troponina y del diámetro de miotubos que ocurre con DCA y CA. Estos resultados podrían ser un indicio para utilizar ERK como blanco terapéutico para un futuro tratamiento en pacientes con este tipo de enfermedades, de tal manera de mejorar su calidad de vida y sobrevivencia ante un trasplante de hígado.Ítem Astrocitos SOD1 y TDP-43 mutantes secretan factores que gatillan la fosforilación de c-Abl en neuronas motoras : rol de los canales de sodio y estrés oxidativo(Universidad Andrés Bello, 2015) González Figueroa, David Andrés; Zundert, Brigitte van; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad fatal que evidencia sus síntomas en la adultez generando un desorden paralítico causado por la degeneración de neuronas motoras craneales, tronco encefálico y de medula espinal. Existe evidencia en la literatura que muestra que mutaciones en el gen superóxido dismutasa 1 (SOD1) y TAR DNA binding protein 43 (TDP-43) entre otros genes, están relacionadas con la patogénesis de la enfermedad. Los astrocitos son las células no neuronales más abundantes en el sistema nervioso central y su rol en la degeneración neuronal aún no está del todo claro. En 2006, se estableció un nuevo modelo in vitro en el cual se induce la muerte específica de neuronas motoras cuando los cultivos primarios de médula espinal son expuestos a un medio condicionado derivado de astrocitos (MCA) proveniente de ratones transgénicos hSODlG93A. La tirosina quinasa no receptora Abelson (c-Abl), se ha visto involucrada en enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson y Niemann-Pick y en donde su activación se gatilla principalmente en respuesta a estrés oxidativo, fibras A(3 y daño del ADN. Esta evidencia nos llevó a generar la siguiente hipótesis: "La liberación de factores tóxicos por parte de astrocitos mutantes SOD1 3A/TDP43A3i5T inducen la actividad de cAbl en neuronas motoras. Resultados de esta tesis mostraron que la incubación de cultivos primarios de espina dorsal con MCA mutantes hSOD1G93A y TDP-43` l5T gatilla la fosforilación de c-Abl. Además, la co-incubación de cultivos primarios con MCA junto a antioxidantes o bloqueadores de canales de sodio previene la fosforilación de c-Abl. Más aún, se vio una activación de c-Abl en ratones transgénicos hSOD 1 G93A post-sintomáticos mediante western-blot e inmunofluorescencia. Estos datos sugieren que la muerte de neuronas motoras podría estar mediada por la activación de c-Abl en respuesta a hiperexcitabilidad y estrés oxidativo.Ítem Purificación y caracterización de un elemento difusible tipo bacteriocina producida por staphylococcus epidermidis contra porphyromonas gingivalis(Universidad Andrés Bello, 2013) González Candia, Alejandro Antonio; Bittner Ortega, Mauricio; Castillo R., Mario; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa periodontitis o enfermedad periodontal, es una de las enfermedades más prevalentes en todo el mundo, es una infección inflamatoria que afecta a las estructuras de soporte de los dientes y se caracteriza por la destrucción progresiva del ligamento periodontal y el hueso alveolar que puede resultar en la pérdida de la pieza dental. Porphyromonas gingivales es una bacteria anaeróbica Gram negativo considerado uno de los agentes etiológicos más importantes implicados en el establecimiento y la progresión de la En la microbiota oral las especies bacterias se encuentran manteniendo relaciones sinérgicas y antagónicas, estas últimas incluyen sustancias que inhiben el crecimiento de otros microorganismos, tales como productos metabólicos, sustancias tipo antibióticos, enzimas bacterioliticas y bacteriocinas, estas son polipéptidos que poseen actividad antimicrobiana y son producidas por un gran número de bacterias. En esta tesis se purificó y caracterizó un elemento difusible tipo bacteriocina producido por Staphylococcus epidermidis capaz de inhibir el crecimiento de Porphyromonas gingivalis. .La purificación se realizó mediante HPLC-RF y MALDI-TOFMS obteniendo 2 peacks con actividad de masas 2732 Da y 5795 Da, este elemento difusible fue resistente al tratamiento con temperatura y pH pero parcialmente resistente al tratamiento con proteinasas. Nuestros resultados indican el aislamiento de un nuevo elemento difusible tipo bacteriocina de origen Staphylococcal capaz de inhibir a Porphyromonas gingivales.Ítem Estudio de la localización subcelular de las isoformas de la proteína X (HBx) del virus de la hepatitis B (HBV)(Universidad Andrés Bello, 2017) Garrido Norambuena, Daniel Gervasio; Loyola Pedevila, Alejandra; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaEl Virus de la Hepatitis B (HBV) codifica para la proteína X (IiBx), una pequeña proteína no estructural a la cual se le atribuyen múltiples funciones dentro de la célula infectada, tales como controlar el ciclo replicativo viral, regular el ciclo celular y participar en el desarrollo del Carcinoma Hepatocelular (HCC). El transcrito de HBx posee codones internos de inicio de la traducción, lo cual sugiere la traducción de isoformas de HBx. La localización subcelular de HBx varía según su nivel de expresión, localizándose en el núcleo a bajos niveles de expresión y en el citoplasma a altos niveles de expresión. Nuestra hipótesis considera que las isoformas de HBx tienen una localización subcelular distinta cuando son expresadas de manera individual y que varía según su nivel de expresión. Para investigar esto se generaron mutantes que expresan de manera individual cada isoforma, y luego, mediante técnicas de fluorescencia, se determinó la localización subcelular de cada isoforma, variando además su nivel de expresión. Los resultados de microscopía indican que cada isoforma de manera individual presenta una localización subcelular diferente. Además, al expresarlas en combinaciones, la localización final también varía. Finalmente sería importante analizar a futuro cómo estas isoformas interactúan entre sí, siendo de manera directa o mediante otras proteínas, así como también analizar el comportamiento de las isoformas en el contexto viral.Ítem Identificación y caracterización de genes inducidos por exceso de Boro en Chenopodium quinoa(Universidad Andrés Bello, 2015) Galleguillos de la Fuente, María Jesús; Krauskopf, Erwin; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaQuínoa o Chenopodium quina es una planta nativa del altiplano andino que se adapta a las condiciones extremas de su entorno como a altos contenidos de boro en el suelo, de hecho se determinó previamente que el ecotipo R-49 presenta tolerancia a altas concentraciones de Boro. El boro es un elemento esencial para las plantas por formar parte de la pared de las células vegetales, pero su exceso produce toxicidad. Existen mecanismos descritos por los cuales algunas especies vegetales poseen tolerancia al exceso de boro en su medio de crecimiento, entre los que destacan la variación en la expresión de algunos transportadores de boro como NIP5;1, BOR1 y BOR4. A través de técnicas de secuenciación masiva como RNA-Seq se han identificado transcritos que caracterizan la respuesta a distintos estrés abióticos. Por esta razón, se utilizó esta técnica para estudiar la respuesta de quínoa frente a una situación de exceso de boro con el objetivo de identificar posibles transcritos asociados a la tolerancia de esta planta. A partir del estudio de los transcritos que más variaron su expresión en el RNA-Seq, se identificaron una serie de posibles proteínas asociadas a respuesta a estrés. Destacó el componente c186654 gl, el cual codifica para una proteína putativa denominada CgREB. A través de análisis in silico se identificaron entre 2 a 3 dominios transmembrana y posibles modificaciones post-traduccionales dentro de las que destaca la miristoilación. Por lo que se propone que CgREB podría formar parte de la cadena de transducción de señales en respuesta a un exceso de boro. Por otro lado, a través del estudio de los transportadores de boro en el transcriptoma de referencia construido a través del RNA-Seq, se identificó el componente c171835_gl_i2 como un posible ortólogo de NIP5;1 en quínoa (CgNIP5;1), debido a que presenta las características aminoacídicas que posee este canal en otros organismos vegetales. Por último, se confirmó por PCR en tiempo real el aumento de la expresión relativa frente a un exceso de boro de los componentes que codifican para CgREB y CgNIP5;1. Se sugiere que CgNIP5;1 participaría en la tolerancia de Chenopodium quina a las altas concentraciones de ácido bórico.Ítem Rol del RNA no codificante SroC en la motilidad de Salmonella Typhimurium(Universidad Andrés Bello, 2016) Fuentes Peña, Danitza Natalia; Calderón, Iván; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaLa regulación de la expresión génica en bacterias incluye la interacción de diversos tipos de moléculas, tales como el apareamiento de bases de los RNAs pequeños no codificantes (sRNAs) con sus respectivos RNAs mensajeros blanco. SroC, un sRNA de Salmonella Typhimurium con función desconocida hasta ahora, se expresa principalmente en la fase exponencial tardía de crecimiento. Mediante un análisis bioinformátivo se determinó que los genes flagelares flhB, fliE y fliJ son posibles blancos de SroC. Interesantemente, la expresión de estos genes flagelares es reprimida en fase exponencial tardía de crecimiento. En este trabajo se propuso determinar el rol de SroC en la regulación negativa de la motilidad de S. Typhimurium y la consecuente transición a un estado sésil de biopelícula. La evaluación del fenotipo mótil, permitió establecer que la cepa mutante deficiente en SroC (AsroC) posee mayor motilidad, mientras que la que sobreexpresa SroC (pSroC) muestra un fenotipo no motil, en comparación con la cepa silvestre. Mediante microscopía electrónica se determinó que la cepa pSroC no presenta flagelos y se agrega, a diferencia de la mutante que mas bien presenta un fenotipo hiperflagelado. Estos resultados se correlacionan con la formación de biopelícula, donde la ausencia de SroC reduce la formación de biopelícula mientras que la sobrexpresión de SroC la aumenta. Por otra parte, la expresión de los genes flagelares identificados como posibles blancos de SroC aumenta en la cepa dsroC, mientras que en la cepa pSroC disminuye significativamente, sugiriendo un rol regulador negativo por parte del sRNA. Ensayos de co-expresión heteróloga utilizando pSroC y fusiones traduccionales reporteras de los genes flagelares, demuestran que SroC interacciona directamente con los mRNAs flhB y fliJ. Los resultados en su conjunto indican que el sRNA SroC de S. Typhimurium regula la síntesis flagelar mediante la inhibición directa y post-transcripcional de la expresión de flhB y fliJ e indirectamente la expresión de fllE, estimulando a su vez la formación de biopelícula en la bacteria.Ítem Participación de los genes cysK y cysM en la resistencia a antibióticos bactericidas(Universidad Andrés Bello, 2017) Frávega Ammann, Jorge Matías; Gil Michell, Fernando RafaelLos antibióticos bactericidas, además de su efecto primario, producen un aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs) al interior de la bacteria debido al aumento en la razón NADt / NADH proveniente del Ciclo de Krebs. Ante esto, la bacteria es capaz de modificar el perfil de expresión génica, incluyendo una serie de genes y reguladores transcripcionales involucrados en el metabolismo del azufre. Uno de los sustratos para la síntesis de cisteína, el sulfuro de hidrógeno (H2S), durante años fue considerado como un sub-producto de desecho en las bacterias. Sin embargo, este compuesto es de gran interés ya que se ha demostrado que actúa como un antioxidante protegiendo a la bacteria ante EROs, probablemente estimulando enzimas antioxidantes como catalasas y SOD, secuestrando además del ion ferroso a la cisteína libre, los cuales promueven la reacción de Fenton. El paso final en la síntesis de cisteína es catalizado por las enzimas CysK ó CysM, codificadas por los genes cysK y cysM, las que utilizan H2S y O-Acetilserina (OAS) u OAcetilserina (OAS) y S2O3 respectivamente. Considerando que la cisteína en exceso promueve la reacción de Fenton y que los antibióticos bactericidas aumentan las EROs intracelulares, en el presente trabajo, postulamos que cepas de S. Typhimurium mutantes para cysK son más resistentes frente al tratamiento con ofloxacino (antibiótico bactericida perteneciente a las quinolonas), debido a que en dicha mutante se favorecería la acumulación de H2S (antioxidante) y se vería disminuida la acumulación de cisteína (prooxidante al estar en exceso). Mediante determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) y curvas de supervivencia, encontramos que la mutante ¿cysK es más resistente a ofloxacino. Además, esta cepa produce menos cisteína y acumula mayor cantidad de H2S frente al tratamiento con ofloxacino, sumado al hecho de que también presenta menos daño en el DNA en comparación a la cepa WT. Finalmente, al evaluar los niveles de transcrito del gen cysK en las cepas WT y OcysM, se observó una disminución durante el tratamiento con ofloxacino Estos resultados explicarían el aumento en la resistencia frente a ofloxacino, dando a conocer un nuevo mecanismo asociado a la resistencia a antibióticos.Ítem Análisis del perfil de metilación de DNA en el genotipo F del virus de la hepatitis B(Universidad Andrés Bello, 2015) Flores León, Yvo; Loyola Pedevila, Alejandra; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias BiológicasEl DNA circular covalentemente cerrado (cccDNA) del virus de la hepatitis B (HBV) es el causante de la persistencia viral en infecciones crónicas. Este cccDNA, organizado como un minicromosoma en el núcleo del hepatocito infectado, se encuentra metilado en sitios CpG en al menos dos de los diez genotipos de HBV descritos (genotipos A y D). Con el objetivo de identificar metilaciones de DNA en el genotipo de HBV prevalente en Chile (genotipo F), se utilizó un sistema de cultivo en células hepáticas humanas Huh7 transfectadas con el genoma viral. El cccDNA aislado se digirió con la enzima de restricción HpaII, sensible a metilación de DNA. Mediante PCR en tiempo real se determinó el Índice de Metilación (IM) en 3 sitios HpaII situados en la Isla CpG II (CpG II); Isla CpG III (CpG III) y dentro del ORF del gen S (CpG S). El IM de estos 3 sitios CpG sugiere que la molécula de cccDNA del genotipo F se encuentra metilada luego de 24 h post-transfección. Además, estudiamos la dinámica de la metilación del cccDNA, utilizando el inhibidor de DNA metiltransferasas procaína, el cual disminuyó el IM de los sitios CpG II y CpG S. Al utilizar inhibidores de enzimas que modifican la cromatina como es el butirato de sodio (un inhibidor de desacetilasas de histonas), y la pargilina (un inhibidor de la desmetilasa de histona H3, LSD1), se observó que el butirato de sodio aumentó significativamente el TM tanto en CpG II como en CpG III, mientras que, por el contrario, la pargilina no afectó la metilación del cccDNA. Por lo tanto, nuestro trabajo entrega evidencias del estado de metilación del intermediario de replicación del genotipo F de HBV. Lo anterior es un antecedente importante para investigar y entender la regulación de la transcripción y replicación de este virus hepatótropo.Ítem Efecto de mutaciones en sitios potenciales de fosforilación del dominio de la polimerasa del virus de la hepatitis C en la replicación del genoma viral(Universidad Andrés Bello, 2015) Figueroa Figueroa, Daniella Ruth; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias BiológicasLa fosforilación es un mecanismo conocido de regulación de la actividad de diversas proteínas. Dentro de la amplia variedad de proteínas que pueden ser blanco de la acción de kinasas, se encuentran las RNA polimerasas de los virus de RNA de hebra positiva. Una de aquellas enzimas, la proteína NS5B, es la principal encargada de la replicación del genoma del virus de la hepatitis C (HCV). La evidencia sugiere que su actividad podría estar modulada de manera positiva por fosforilación y se ha propuesto anteriormente que los residuos de seria en las posiciones 46, 76, 84, 96, 99 y 112 podrían participar en aquella forma de regulación. Para estudiar lo anterior, se utilizaron replicones subgenómicos de HCV con mutaciones puntales en los residuos de seria señalados, para eliminar la posibilidad de fosforilación o para simular una fosforilación constitutiva en aquellas posiciones. El efecto de dichas mutaciones se analizó en el contexto de los niveles de replicación de los replicones subgenómicos en base ala formación de colonias celulares resistentes a G418 (marcador de resistencia otorgado por los replicones). Los resultados sugieren que las serinas en las posiciones 46, 76 y 99 podrían participar en la regulación de la actividad de NS5B mediante fosforilación. Además, es posible que la fosforilación tenga efectos opuestos dependiendo del residuo que se encuentre fosforilado, ya que la simulación de una fosforilación en las serinas 46 y 76 produce un aumento en los niveles de replicación de replicones subgenómicos, mientras la fosforilación del residuo 99 resulta en una disminución significativa en la replicación del replicón mutante.Ítem Comparación del efecto antifúngico de Clonostachys spp. y Chaetomium spp. sobre Botrytis cinerea : caracterización de las moléculas producidas por el mejor biocontrolador(Universidad Andrés Bello, 2015) Fernández Céspedes, Kamila Paz Margarita; Polanco O., Rubén; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de BioquímicaBotrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que infecta una amplia variedad de frutas y hortalizas, causando la pudrición gris. Uno de los blancos de este fitopatógeno es la uva de mesa de exportación, provocando pérdidas económicas importantes para Chile. Actualmente se utilizan fungicidas químicos para controlar la infección provocada por Botrytis, sin embargo, se ha observado la aparición de cepas resistentes y efectos secundarios. Una alternativa al uso de fungicidas químicos son los controladores biológicos, pero a nivel comercial sólo Trichoderma spp. y Bacillus subtilis, han sido utilizados en precosecha. En nuestro laboratorio se aisló una cepa de Clonostachys rosea (RP1505) y una cepa de Chaetomium globosum (RP2808) capaces de controlar a Botrytis en condiciones de poscosecha de uva de mesa. Según lo reportado en la literatura, C. rosea es mejor biocontrolador de B. cinerea que C. globosum, pero estudios con las cepas de nuestro laboratorio indican lo contrario. Con el objeto de comprender mejor este fenómeno nos planteamos la siguiente hipótesis: La cepa RP2808 es mejor biocontrolador de B. cinerea que la cepa RP1505, ya que produce una mayor diversidad de metabolitos difusibles y termoestables. Se establecieron las mejores condiciones de cultivo de la cepa RP2808 y RP1505 para la producción de metabolitos termoestables con actividad biocontroladora sobre B. cinerea. Utilizando solventes de distinta polaridad, se aislaron los metabolitos contenidos en los extractos con mayor actividad antifúngica de cada cepa y se determinó que la cepa RP2808 produce metabolitos polares y apoares con actividad sobre el crecimiento y la germinación de B. cinerea. En cambio, la cepa RP1505 solamente produce metabolitos polares con actividad antifúngica contra B. cinerea. Mediante análisis de HPLC-MS se identificaron 2 posibles moléculas producidas por RP2808 en medio sólido, que presentan en su estructura un grupo fenilpirrol, descrito en otras moldculas con actividad botricida, por lo que serian responsables del efecto antifúngico.Ítem Efecto de extracto de cáscara de quinua sobre el crecimiento y germinación de Botrytis cinerea y Penicillium italicum : evaluación del posible mecanismo de acción(Universidad Andrés Bello, 2019) Farías González, María José; Palma G., Francisco; Silva Moreno, Evelyn; Krauskopf, Erwin; Facultad de Ciencias BiológicasLos cítricos son los cultivos frutales más importantes a nivel mundial y constituyen una excelente fuente de nutrientes y antioxidantes. La contaminación por hongos es un problema asociado al cultivo de cítricos, lo que genera grandes pérdidas económicas. En los cítricos, los hongos que tienen mayor incidencia son Penicillium italicum (causante del moho azul) y Botrytis cinerea (causante del moho gris). Ambos tienen la capacidad de ingresar al fruto mediante heridas en la superficie de la fruta o por secreción activa de enzimas. Comúnmente, se utilizan fungicidas químicos sintéticos para controlar este tipo de contaminación, lo que ha generado en la última década la aparición de cepas resistentes. El estudio de metabolitos secundarios (MS), obtenidos desde plantas, se vislumbra como una estrategia interesante de explorar para la generación de fungicidas naturales que suplan algunas de las desventajas de los fungicidas sintéticos, tales como la generación de resistencia en cepas de B. cinerea y P. italicum y presencia de residuos de estos en frutas en destino. Las saponinas corresponden a metabolitos secundarios de implicadas en la resistencia al ataque de patógenos, siendo abundantes en la cascarilla de quinua chilena (Chenopodium quinoa). En esta tesis se realizó la extracción de saponinas desde la cascarilla de quinua contemplando 4 etapas principales: (I) maceración, (II) precipitación de proteínas, (III) hidrólisis alcalina y (IV) ajuste de pH. Además, se evaluó el efecto de la temperatura (24 °C y 60 °C) en la etapa I, y el efecto de ausencia o presencia de la etapa III. El extracto 1 fue sometido a calentamiento (60°C) y a la etapa III, el extracto 2 fue sometido a calentamiento (60°C) en la etapa I, y el extracto 3 se mantuvo a 24°C. Finalmente, se evaluó la actividad antifúngica de tres extractos de quinua, enriquecidos en saponinas, sobre el crecimiento y germinación de Penicillium italicum y Botrytis cinerea. Además se estudió el mecanismo de acción que ejercen estos extractos contra el hongo. Los resultados muestran que el extracto 1 presenta una mayor cantidad de saponinas (48,5% peso seco) en comparación a los extractos 2 y 3. También, posee un efecto fungistático relevante en los hongos estudiados, disminuyendo el crecimiento micelial de ambos hongos. Además, los extractos 1, 2 y 3 producen una disminución en el porcentaje de germinación de B. cinerea y P. italicum, pero el efecto de éste último es más notorio. Se encontró que el extracto 1 aumenta la producción de ROS en P. italicum y causa daño en la membrana plasmática de ambos hongos. Los resultados anteriores sugieren que el extracto 1 podría ser utilizado en el desarrollo de algún fungistático.Ítem Dominios de la proteína Gc del virus andes (Hantavirus) : posibles herramientas para inhibir el proceso de fusión(Universidad Andrés Bello, 2009) Vidal Villanueva, Simón Eugenio; Tischler, Nicole,; Valenzuela, PabloLos virus con envoltura lipídica, como el virus Andes (genero Hantavirus), infectan células a través de la fusión de membranas virales y celulares. Dicha fusión es mediada por las glicoproteínas virales conocidas como proteínas de fusión. El proceso de fusión necesita de gatilladores apropiados para que la proteína fusogénica pueda interaccionar con su membrana blanco y posteriormente desencadenar la fusión. Existen al menos tres clases de proteínas de fusión distintas, dentro de las cuales la glicoproteína Ge de los virus Hanta ha sido clasificada en las de clase II. Las proteínas de fusión de clase II poseen tres dominios globulares compuestos mayoritariamente por estructuras de hoja beta. Al activarse, estas proteínas sufren un dramático cambio conformacional, el que consiste en el desplazamiento del dominio III hacia el péptido de fusión generando con esto la fusión de membranas. Para inhibir la actividad fusogénica de la proteína Ge del virus Andes, se sintetizó el dominio III (GcIII) y el dominio III con la región troncal (GcIII-St) en E. coli. Los cuerpos de inclusión de GcIII y GcIII-St fueron purificados y posteriormente solubilizados con agentes desnaturantes. Los dominios solubilizados fueron renaturados y las fracciones monoméricas de GcIII y GcIII-St fueron purificados mediante cromatografla de filtración en gel. La estructura secundaria de los dominios renaturados fue analizada mediante dicroismo circular. Finalmente, la actividad inhibitoria de GcIII, y anticuerpos anti Ge fue estudiada mediante un ensayo de fusión entre células. La actividad inhibitoria de GcIII fue de un 50 % en las condiciones ensayadas, con lo que se demuestra que la presencia del dominio III, podría ser utilizado para inhibir el proceso de fusión desarrollado por el virus.Ítem Análisis de la expresión global de genes asociados a crecimiento muscular en congrio colorado (Genypterus chilensis) bajo respuesta a estrés por manejo(Universidad Andrés Bello, 2014) Aedo Abadie, Jorge Eduardo.; Valdés, Juan Antonio.; Gallardo Escárate, Cristian.; Facultad de Ciencias Biológicas.; Escuela de Bioquímica.La diversificación de la acuicultura en Chile considera la incorporación de nuevos cultivos de peces que permitan posicionar a esta industria como uno de los sectores más importantes de la economía nacional. Dentro de los candidatos propuestos se encuentra el congrio colorado (Genypterus chilensis). Esta especie presenta un alto valor comercial en el mercado producto de la excepcional calidad de su carne blanca. Sin embargo, a pesar de las grandes cualidades que presenta, su proyección comercial se ha visto limitada producto de sus bajas tasas de crecimiento en cautiverio. Considerando que el tejido muscular representa alrededor de un 60% de la masa corporal de un pez, nuestro grupo se ha enfocado en estudiar y entender los mecanismos implicados en el crecimiento y desarrollo muscular en peces, así como también el estudio de variables intrínsecas o extrínsecas asociadas a estos procesos. Dentro de estas variables de encuentra el estrés causado por disturbios físicos relacionados a los métodos de cultivo tales como el manejo (handling stress). El estrés se puede definir como una condición en la cual el equilibrio dinámico de un organismo es perturbado como resultado de la acción de estímulos comúnmente definidos como estresores. A pesar de la extensa bibliografía sobre los efectos de agentes estresantes en el sistema neuro-inmune-endocrino de peces, muchos de los mecanismos moleculares por los cuales el estrés afecta el crecimiento muscular en peces se encuentran pobremente estudiados. Esto se debe principalmente a la falta de información genómica disponible de especies piscícolas. Considerando los antecedentes anteriormente descritos, en este trabajo proponemos como hipótesis que el efecto del estrés por manejo (Handling stress) induce cambios en la expresión global de genes asociados a crecimiento muscular de congrio colorado (G. chilensis) particularmente causando alteraciones en vías asociadas a atrofia muscular. Para verificar esta hipótesis, como primer objetivo se generó un transcriptoma de referencia secuenciado y anotado de G. chilensis mediante el uso de tecnologías de secuenciación masiva. Este comprende un total de 48.480 secuencias del cual un 44% presenta anotación funcional. Como segundo objetivo, se determinó la expresión diferencial de genes en músculo de G. chilensis bajo estrés. Para ello, se secuenciaron transcritos de G. chilensis sometidos a un protocolo de estrés por manejo para su posterior mapeo en el transcriptoma de referencia previamente generado. Un total de 1062 genes variaron su expresión bajo esta condición, dentro de los cuales se encuentran genes asociados a procesos catabólicos, traducción, diferenciación y proliferación celular. Finalmente, como tercer objetivo se validó la expresión diferencial obtenida in silico de ocho genes involucrados en crecimiento y diferenciación muscular por RT- gPCR. Los genes candidatos fueron: Factor de respuesta a daño de DNA (redd-1), Factor de unión a la proteína 4eiF4 (4ebp-1), foxo, atrogina-1 y subunidad 1 reguladora del proteosoma 26S (psdml), todos ellos involucrados en vías de atrofia muscular, junto con smad-2, myoDi y myoD2, los cuales están involucrados en procesos de diferenciación muscular. Todos los niveles de expresión obtenidos por RT-gPCR se correlacionan con los obtenidos por los análisis de RNAseq. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por manejo induce cambios en la expresión global de genes en músculo de G. chilensis, particularmente, encontrándose sobreexpresados genes claves que participan en vías de atrofia del músculo esquelético. Por último, el transcriptoma de referencia generado nos proporciona una fuente invaluable de información genómica de G. chilensis que puede ser utilizada para monitorear la expresión global de genes bajo diferentes condiciones de cultivo de esta importante especie de interés comercial.