Efecto de mutagénesis en sitios potenciales de fosforilación de la proteína X del virus de la hepatitis B, sobre la replicación del genoma viral
No hay miniatura disponible
Archivos
Fecha
2016
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
Título de la revista
ISSN de la revista
Título del volumen
Editor
Universidad Andrés Bello
Nombre de Curso
Licencia CC
Licencia CC
Resumen
El virus de la Hepatitis B (HBV) posee un genoma circular parcial de DNA doble
hebra, que codifica 4 marcos de lectura abiertos. Dentro de estos 4 marcos se encuentra
HBx la cual es una proteína involucrada en la regulación de la replicación viral, aunque se
desconocen sus mecanismos de acción. Nuestro trabajo está enfocado en estudiar la
regulación de la replicación viral que ejerce HBx dependiente de fosforilación en residuos
filogenéticamente conservados, y con alta probabilidad de fosforilación, como son Ser25,
Ser41, y Thr81. Para esto, construimos vectores de expresión de HBx mutantes en sitios de
fosforilación, y adicionalmente un clon molecular del genoma de HBV que no
expresa HBx (HBV X-). Con esto, hemos generado un sistema de replicación de HBV en
líneas celulares de hepatoma humano (Huh-7 o HepG2) donde HBV X(-) pueda ser
complementado en trans con HBx mutantes. Los resultados obtenidos demuestran que la
replicación viral es dependiente de HBx en línea celular HepG2, además los datos de transcomplementación muestran importantes cambios en niveles de replicación viral
dependientes de la fosforilación de HBx como lo observamos a través de la cuantificación
de intermediarios replicativos de DNA viral tanto citoplasmáticos como nucleares y por la
secreción de antígenos virales HBsAg y HBeAg. Estos resultados sugieren que los estados
de fosforilación de la proteína HBx podrían regular la replicación viral.
Hepatitis B virus (HBV) has partial circular double-stranded DNA genome that encodes four open reading frames. Within these four open reading frames is HBx which encodes a protein involved in the regulation of viral replication, but its mechanism of action are unknown. Our work is focused on studying the regulation of viral replication exerted by the phosphorylation of HBx in phylogenetically conserved residues with high probability of phosphorylation, i.e. Ser25, Ser41 and Thr81. For this purpose, we constructed expression vectors to ectopically express HBx mutants in phosphorylation sites, and additionally a molecular clone of HBV genome that does not express HBx (HBV X(-)). With this, we have created a system of HBV replication in human hepatoma cell lines (Huh-7 or HepG2) where X can be complemented in trans with HBx mutants. Our results demonstrate that viral replication is dependent of HBx in HepG2 cell line, our data also demonstrate that trans-complementation of the HBV genome deficient in HBx-with the different phosphorylation mutants of HBx shows significant changes in levels of viral replication as observed by the quantification of viral DNA replicative intermediates from both cytoplasm and nucleus, and secretion of viral antigens, i.e. HBsAg and HBeAg. These results suggest that phosphorylation states of the HBx protein might regulate viral replication.
Hepatitis B virus (HBV) has partial circular double-stranded DNA genome that encodes four open reading frames. Within these four open reading frames is HBx which encodes a protein involved in the regulation of viral replication, but its mechanism of action are unknown. Our work is focused on studying the regulation of viral replication exerted by the phosphorylation of HBx in phylogenetically conserved residues with high probability of phosphorylation, i.e. Ser25, Ser41 and Thr81. For this purpose, we constructed expression vectors to ectopically express HBx mutants in phosphorylation sites, and additionally a molecular clone of HBV genome that does not express HBx (HBV X(-)). With this, we have created a system of HBV replication in human hepatoma cell lines (Huh-7 or HepG2) where X can be complemented in trans with HBx mutants. Our results demonstrate that viral replication is dependent of HBx in HepG2 cell line, our data also demonstrate that trans-complementation of the HBV genome deficient in HBx-with the different phosphorylation mutants of HBx shows significant changes in levels of viral replication as observed by the quantification of viral DNA replicative intermediates from both cytoplasm and nucleus, and secretion of viral antigens, i.e. HBsAg and HBeAg. These results suggest that phosphorylation states of the HBx protein might regulate viral replication.
Notas
Tesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Virus Hepatitis de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello y fue financiada por el proyecto ANILLO ACT1119.
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Virus Hepatitis de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello y fue financiada por el proyecto ANILLO ACT1119.
Palabras clave
Mutagénesis, Fosforilación, Hepatitis B, Genoma Viral