Análisis del perfil de metilación de DNA en el genotipo F del virus de la hepatitis B
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Fecha
2015
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
Título de la revista
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Editor
Universidad Andrés Bello
Nombre de Curso
Licencia CC
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Resumen
El DNA circular covalentemente cerrado (cccDNA) del virus de la hepatitis B
(HBV) es el causante de la persistencia viral en infecciones crónicas. Este cccDNA,
organizado como un minicromosoma en el núcleo del hepatocito infectado, se encuentra
metilado en sitios CpG en al menos dos de los diez genotipos de HBV descritos (genotipos
A y D). Con el objetivo de identificar metilaciones de DNA en el genotipo de HBV
prevalente en Chile (genotipo F), se utilizó un sistema de cultivo en células hepáticas
humanas Huh7 transfectadas con el genoma viral. El cccDNA aislado se digirió con la
enzima de restricción HpaII, sensible a metilación de DNA. Mediante PCR en tiempo real
se determinó el Índice de Metilación (IM) en 3 sitios HpaII situados en la Isla CpG II (CpG
II); Isla CpG III (CpG III) y dentro del ORF del gen S (CpG S). El IM de estos 3 sitios CpG
sugiere que la molécula de cccDNA del genotipo F se encuentra metilada luego de 24 h
post-transfección. Además, estudiamos la dinámica de la metilación del cccDNA,
utilizando el inhibidor de DNA metiltransferasas procaína, el cual disminuyó el IM de los
sitios CpG II y CpG S. Al utilizar inhibidores de enzimas que modifican la cromatina como
es el butirato de sodio (un inhibidor de desacetilasas de histonas), y la pargilina (un
inhibidor de la desmetilasa de histona H3, LSD1), se observó que el butirato de sodio
aumentó significativamente el TM tanto en CpG II como en CpG III, mientras que, por el
contrario, la pargilina no afectó la metilación del cccDNA. Por lo tanto, nuestro trabajo
entrega evidencias del estado de metilación del intermediario de replicación del genotipo F
de HBV. Lo anterior es un antecedente importante para investigar y entender la regulación
de la transcripción y replicación de este virus hepatótropo.
Covalently closed circular DNA (cccDNA) of hepatitis B virus (HBV) is responsible for viral persistence in chronic infections. CccDNA, organized as a minichromosome in the nucleus of infected hepatocytes, is methylated in CpG sites in at least two of the ten described HBV genotypes (genotypes A and D). In order to characterize DNA methylation in the prevalent HBV genotype in Chile (genotype F), a human culture system was used transfecting the hepatoma cell line Huh7 with the viral genome. Isolated cccDNA was digested with the DNA methylation sensitive restriction enzyme HpaII. Realtime PCR was performed to determine the Methylation Index on three HpaII sites located in the Island II (CpG II); Island III (CpG III) and within the ORF of the S gene (CpG S). The Methylation Index of these three sites suggests that CpGs on the cccDNA genotype F are methylated 24 h post transfection. We also investigated the dynamics of cccDNA methylation using the DNA methyltransferase inhibitor procainé, which decreased the Methylation Index on CpG II and CpG S sites. Using the chromatin modifying enzymes inhibitors sodium butyrate (an inhibitor of histone deacetylase), and pargyline (an inhibitor of histone H3 demethylase, LSD 1) we showed that sodium butyrate significantly increased the Methylation Index on CpG II and CpG III sites, in contrast, pargyline did not affect cccDNA methylation. Therefore, our work gives evidence about the DNA methylation status on this replicative intermediary of HBV genotype F, necessary information to investigate and understand the regulation of transcription and replication of this hepatotropic virus.
Covalently closed circular DNA (cccDNA) of hepatitis B virus (HBV) is responsible for viral persistence in chronic infections. CccDNA, organized as a minichromosome in the nucleus of infected hepatocytes, is methylated in CpG sites in at least two of the ten described HBV genotypes (genotypes A and D). In order to characterize DNA methylation in the prevalent HBV genotype in Chile (genotype F), a human culture system was used transfecting the hepatoma cell line Huh7 with the viral genome. Isolated cccDNA was digested with the DNA methylation sensitive restriction enzyme HpaII. Realtime PCR was performed to determine the Methylation Index on three HpaII sites located in the Island II (CpG II); Island III (CpG III) and within the ORF of the S gene (CpG S). The Methylation Index of these three sites suggests that CpGs on the cccDNA genotype F are methylated 24 h post transfection. We also investigated the dynamics of cccDNA methylation using the DNA methyltransferase inhibitor procainé, which decreased the Methylation Index on CpG II and CpG S sites. Using the chromatin modifying enzymes inhibitors sodium butyrate (an inhibitor of histone deacetylase), and pargyline (an inhibitor of histone H3 demethylase, LSD 1) we showed that sodium butyrate significantly increased the Methylation Index on CpG II and CpG III sites, in contrast, pargyline did not affect cccDNA methylation. Therefore, our work gives evidence about the DNA methylation status on this replicative intermediary of HBV genotype F, necessary information to investigate and understand the regulation of transcription and replication of this hepatotropic virus.
Notas
Tesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Cromatina y Epigenética de la Fundación Ciencia & Vida y se financió por el proyecto ANILLO ACT1119, proyecto BASAL PFB-16 y proyecto FONDECYT 1120170 de CONICYT.
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Cromatina y Epigenética de la Fundación Ciencia & Vida y se financió por el proyecto ANILLO ACT1119, proyecto BASAL PFB-16 y proyecto FONDECYT 1120170 de CONICYT.
Palabras clave
Metilación, Hepatitis B, Genotipo, Análisis