Efecto de mutaciones en sitios potenciales de fosforilación del dominio de la polimerasa del virus de la hepatitis C en la replicación del genoma viral
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Fecha
2015
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
Título de la revista
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Editor
Universidad Andrés Bello
Nombre de Curso
Licencia CC
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Resumen
La fosforilación es un mecanismo conocido de regulación de la actividad de diversas
proteínas. Dentro de la amplia variedad de proteínas que pueden ser blanco de la acción de
kinasas, se encuentran las RNA polimerasas de los virus de RNA de hebra positiva. Una de
aquellas enzimas, la proteína NS5B, es la principal encargada de la replicación del genoma
del virus de la hepatitis C (HCV). La evidencia sugiere que su actividad podría estar
modulada de manera positiva por fosforilación y se ha propuesto anteriormente que los
residuos de seria en las posiciones 46, 76, 84, 96, 99 y 112 podrían participar en aquella
forma de regulación. Para estudiar lo anterior, se utilizaron replicones subgenómicos de HCV
con mutaciones puntales en los residuos de seria señalados, para eliminar la posibilidad de
fosforilación o para simular una fosforilación constitutiva en aquellas posiciones. El efecto
de dichas mutaciones se analizó en el contexto de los niveles de replicación de los replicones
subgenómicos en base ala formación de colonias celulares resistentes a G418 (marcador de
resistencia otorgado por los replicones). Los resultados sugieren que las serinas en las
posiciones 46, 76 y 99 podrían participar en la regulación de la actividad de NS5B mediante
fosforilación. Además, es posible que la fosforilación tenga efectos opuestos dependiendo
del residuo que se encuentre fosforilado, ya que la simulación de una fosforilación en las
serinas 46 y 76 produce un aumento en los niveles de replicación de replicones
subgenómicos, mientras la fosforilación del residuo 99 resulta en una disminución
significativa en la replicación del replicón mutante.
Phosphorylation is a well-known mechanism regulating the activity of various proteins. Among the wide variety of proteins that can be targeted by the action of kinases are the RNA polymerases of positive strand RNA viruses. One of those enzymes, the NS5B protein, is primarily responsible for the replication of hepatitis C virus (HCV) genome. The evidence suggests that its activity could be positively modulated by phosphorylation and it has been proposed that serine residues in the 46, 76, 84, 96, 99 and 112 positions could be engaged in that form of regulation. To study this, we used HCV subgenomic replicons with point mutations in those identified serine residues, which either eliminates the possibility of phosphorylation or simulates a constitutive phosphorylation at those positions. Here we analyzed the effect of such mutations in the context of levels of replication of subgenomic replicons based on the formation of G418-resistant cell colonies (resistance marker conferred by the replicon). The results suggest that serines at positions 46, 76 and 99 could be involved in regulating the activity of NS5B by phosphorylation. It is also possible that phosphorylation has opposite effects depending on the residue that is phosphorylated, as simulating a phosphorylation at serines 46 and 76 produces increased levels of subgenomic replicon replication, while phosphorylation of residue 99 ends up in a significant decrease in the replication of that mutant replicon.
Phosphorylation is a well-known mechanism regulating the activity of various proteins. Among the wide variety of proteins that can be targeted by the action of kinases are the RNA polymerases of positive strand RNA viruses. One of those enzymes, the NS5B protein, is primarily responsible for the replication of hepatitis C virus (HCV) genome. The evidence suggests that its activity could be positively modulated by phosphorylation and it has been proposed that serine residues in the 46, 76, 84, 96, 99 and 112 positions could be engaged in that form of regulation. To study this, we used HCV subgenomic replicons with point mutations in those identified serine residues, which either eliminates the possibility of phosphorylation or simulates a constitutive phosphorylation at those positions. Here we analyzed the effect of such mutations in the context of levels of replication of subgenomic replicons based on the formation of G418-resistant cell colonies (resistance marker conferred by the replicon). The results suggest that serines at positions 46, 76 and 99 could be involved in regulating the activity of NS5B by phosphorylation. It is also possible that phosphorylation has opposite effects depending on the residue that is phosphorylated, as simulating a phosphorylation at serines 46 and 76 produces increased levels of subgenomic replicon replication, while phosphorylation of residue 99 ends up in a significant decrease in the replication of that mutant replicon.
Notas
Tesis (Bioquímica, Magíster en Bioquímica)
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Virus Hepatitis de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello, y fue financiada por el proyecto FONDECYT N° 1100200.
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Virus Hepatitis de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello, y fue financiada por el proyecto FONDECYT N° 1100200.
Palabras clave
Fosforilación, Hepatitis C, Genoma Viral, Serina