Role of Clostridioides difficile spore surface proteins and toxins in spore interaction with the intestinal mucosa and recurrence of the disease
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Fecha
2020
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Idioma
en
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
Licencia CC
Resumen
Recurrence of Clostridioides diffici/e infections (R-CDI) occurs in ~20% of
successfully treated patients, representing a major clinical challenge due to the
increasing severity and mortality rates after subsequent R-CDI episodes. C. difficile
infection (CDI) is considered a nosocomial infection. Antibiotics use is the main risk
factor. C. difficile produces spores that are crucial for transmission and R-CDI, and toxins
that generate the clinical symptoms. Understanding the molecular and cellular
mechanisms used by C. diffici/e spores to cause R-CDI is critica! to the design of
therapies. We recently showed that C. difficile spores internalize into intestinal epithelial
cells in the presence of fibronectin (Fn) and vitronectin (Vn). Besides, administration of
drugs that inhibit spore entry in vitro to an R-CDI animal model showed to reduce the
R-CDI rates.
This work aimed to identify C. difficile spore exosporium proteins involved in the
spore interaction with the intestinal mucosa and evaluate its role in R-CDI, also identify
the role of C. difficile toxins TcdA and TcdB in the spore interaction with intestinal
epithelial cells in vitro and in vivo and to test the use of FDA-approved drugs in the
inhibition of spore interaction with the intestinal mucosa. We used confocal image
analysis of intestinal mucosa using a ligated ileal/colonic loop mouse model to
accomplish this aim. We showed that the insertional mutants of C. difficile spores for
morphogenic spore factors CdeC (cdeC) and perhaps CdeM (cdeM) exhibited reduced
adherence to the intestinal mucosa. Afterward, using animal models of R-CDI, we
observed that cdeC but not cdeM mutant spores shown an increased severity during R CDI. Using the intestinal ligated loop model, we observed that bc/A3 isogenic mutant
exhibited a reduced adherence in the intestinal mucosa. Also, by confocal microscopy,
we showed that C. diffici/e toxins TcdA and TcdB produce a rearrangement of the ileum
mucosa, increasing the luminal accessibility of the proteins required for the entry of C.
difficile spores, such as Fn, Vn, and the integrins as and av. Besides, TcdA and TcdB
increase the secretion of Fn and Vn, that bind to C. diffici/e spores. These toxins also
contribute to spore adherence and internalization to intestinal epithelial cells. On the
other hand, we observed that TcdB alone produces a rearrangement of the ileum
mucosa that affects the accessibility of Fn and Vn and favors spore interaction with the
intestinal mucosa. However, blocking TcdB with bezlotoxumab tends to decrease the
spore adherence in the ileum mucosa.
Finally, we tested the therapeutic potential of the FDA-approved nonsteroidal
anti-inflammatory drug, indomethacin in a R-CDI animal model. Unexpectedly, we
observed that indomethacin increases CDI severity. Also, we tested the FDA-approved
antifungal nystatin and we observed that tends to reduce the spore interaction with the
intestinal mucosa.
These findings give additional knowledge for the design of novel therapies that
consider the importance of the spore interaction with the intestinal mucosa during C.
diffici/e infection treatment. Our results provide new insight for nystatin as an inhibitor
of spore interaction with the intestinal mucosa with potential to reduce the R-CDI rates.
Las infecciones recurrentes por Clostridioides difficile (R-CDI) ocurren en ~20% de los pacientes tratados con éxito lo cual representa un desafío clínico importante debido al aumento en las tasas de severidad y mortalidad en episodios subsecuentes de R-CDI. La infección por C. dífficile (CDI) es considerada una enfermedad nosocomial. El uso de antibióticos es el principal factor de riesgo. C. diffici/e produce esporas que son cruciales para la transmisión y la R-CDI, y produce toxinas, que generan los síntomas clínicos. Por lo cual, comprender los mecanismos moleculares que utilizan las esporas de C. difficí/e para causar una R-CDI es clave para el diseño de terapias. Recientemente demostramos que las esporas de C. difficile son capaces de entrar en las células epiteliales intestinales en presencia de fibronectina (Fn) y vitronectina (Vn). Además, que la administración de medicamentos que inhiben la entrada de esporas in vitro, en modelo animal de R-CDI mostró que su administración reduce las tasas de R-CDI . El objetivo de este trabajo fue identificar proteínas del exosporium de la espora de C. diffici!e involucradas en la interacción con la mucosa intestinal y evaluar su rol en la R-CDI, también identificar el papel de las toxinas de C. difficile TcdA and TcdB en la interacción de las esporas con células epiteliales intestinales in vitro e in vivo y evaluar el uso de medicamentos aprobados por la FDA en la inhibición de la interacción de las esporas con la mucosa intestinal. Para lograr este objetivo, realizamos análisis de imágenes de microscopía confocal de la mucosa intestinal utilizando un modelo de asa ligada de íleo y colon en ratones. Observamos que mutantes de inserción de C. diffíci/e para los factores morfogénicos de las esporas CdeC ( CdeC) y tal vez CdeM (CdeM) presentaron una adherencia reducida en la mucosa intestinal. Posteriormente con el uso de modelos animales de R-CDI, observamos que las esporas mutantes de cdeC pero no de cdeM mostraron una mayor severidad durante la R-CDI. Usando modelo de asa ligada intestinal, observamos que el mutante isogénico bc/A3 exhibió una adherencia reducida en la mucosa intestinal. Además, mediante microscopía confocal, mostramos que las toxinas de C. diffici/e TcdA y TcdB producen un reordenamiento de la mucosa del íleo. Este reordenamiento aumenta la accesibilidad luminal de las proteínas necesarias para la entrada de las esporas de C. diffícile tales como Fn, Vn y las integrinas as y av. También las toxinas TcdA y TcdB aumenta la secreción de Fn y Vn, que se unen a las esporas de C. diffici/e. Estas toxinas también contribuyen con la adherencia y entrada de las esporas a células epiteliales intestinales. Por otro lado, observamos que TcdB por si sola produce un reordenamiento de la mucosa del íleo que afecta la accesibilidad de Fn y Vn y favorece la interacción con la mucosa intestinal. Sin embargo, el bloqueo de TcdB con bezlotoxumab tiende a reducir la adherencia de las esporas en la mucosa del íleo. Finalmente probamos el potencial terapéutico de indometacina, un antinflamatorio no esteroideo aprobado por la FDA, en un modelo de R-CDI. De forma inesperada observamos que en modelos animales la indometacina aumenta la gravedad de la CDI. Además, probamos el antifúngico aprobado por la FDA, nistatina y observamos que tiende a reducir la interacción de la espora en la mucosa intestinal. Estos hallazgos otorgan conocimiento adicional para el diseño de terapias novedosas que consideran la importancia de la interacción de las esporas con la mucosa intestintal durante el tratamiento de la infección por C. díffící/e. Nuestros resultados entregan una nueva perspectiva sobre el uso de la nistatina como inhibidor de la interacción con la mucosa intestinal con potencial para reducir las tasas de R-CDI.
Las infecciones recurrentes por Clostridioides difficile (R-CDI) ocurren en ~20% de los pacientes tratados con éxito lo cual representa un desafío clínico importante debido al aumento en las tasas de severidad y mortalidad en episodios subsecuentes de R-CDI. La infección por C. dífficile (CDI) es considerada una enfermedad nosocomial. El uso de antibióticos es el principal factor de riesgo. C. diffici/e produce esporas que son cruciales para la transmisión y la R-CDI, y produce toxinas, que generan los síntomas clínicos. Por lo cual, comprender los mecanismos moleculares que utilizan las esporas de C. difficí/e para causar una R-CDI es clave para el diseño de terapias. Recientemente demostramos que las esporas de C. difficile son capaces de entrar en las células epiteliales intestinales en presencia de fibronectina (Fn) y vitronectina (Vn). Además, que la administración de medicamentos que inhiben la entrada de esporas in vitro, en modelo animal de R-CDI mostró que su administración reduce las tasas de R-CDI . El objetivo de este trabajo fue identificar proteínas del exosporium de la espora de C. diffici!e involucradas en la interacción con la mucosa intestinal y evaluar su rol en la R-CDI, también identificar el papel de las toxinas de C. difficile TcdA and TcdB en la interacción de las esporas con células epiteliales intestinales in vitro e in vivo y evaluar el uso de medicamentos aprobados por la FDA en la inhibición de la interacción de las esporas con la mucosa intestinal. Para lograr este objetivo, realizamos análisis de imágenes de microscopía confocal de la mucosa intestinal utilizando un modelo de asa ligada de íleo y colon en ratones. Observamos que mutantes de inserción de C. diffíci/e para los factores morfogénicos de las esporas CdeC ( CdeC) y tal vez CdeM (CdeM) presentaron una adherencia reducida en la mucosa intestinal. Posteriormente con el uso de modelos animales de R-CDI, observamos que las esporas mutantes de cdeC pero no de cdeM mostraron una mayor severidad durante la R-CDI. Usando modelo de asa ligada intestinal, observamos que el mutante isogénico bc/A3 exhibió una adherencia reducida en la mucosa intestinal. Además, mediante microscopía confocal, mostramos que las toxinas de C. diffici/e TcdA y TcdB producen un reordenamiento de la mucosa del íleo. Este reordenamiento aumenta la accesibilidad luminal de las proteínas necesarias para la entrada de las esporas de C. diffícile tales como Fn, Vn y las integrinas as y av. También las toxinas TcdA y TcdB aumenta la secreción de Fn y Vn, que se unen a las esporas de C. diffici/e. Estas toxinas también contribuyen con la adherencia y entrada de las esporas a células epiteliales intestinales. Por otro lado, observamos que TcdB por si sola produce un reordenamiento de la mucosa del íleo que afecta la accesibilidad de Fn y Vn y favorece la interacción con la mucosa intestinal. Sin embargo, el bloqueo de TcdB con bezlotoxumab tiende a reducir la adherencia de las esporas en la mucosa del íleo. Finalmente probamos el potencial terapéutico de indometacina, un antinflamatorio no esteroideo aprobado por la FDA, en un modelo de R-CDI. De forma inesperada observamos que en modelos animales la indometacina aumenta la gravedad de la CDI. Además, probamos el antifúngico aprobado por la FDA, nistatina y observamos que tiende a reducir la interacción de la espora en la mucosa intestinal. Estos hallazgos otorgan conocimiento adicional para el diseño de terapias novedosas que consideran la importancia de la interacción de las esporas con la mucosa intestintal durante el tratamiento de la infección por C. díffící/e. Nuestros resultados entregan una nueva perspectiva sobre el uso de la nistatina como inhibidor de la interacción con la mucosa intestinal con potencial para reducir las tasas de R-CDI.
Notas
Tesis (Doctor en Biotecnología)
Palabras clave
Clostridium Difficile, Investigaciones, Proteínas