Determinantes estructurales para el sitio de unión a nucleótido en riboquinasa de Homo sapiens
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Fecha
2012
Autores
Profesor/a Guía
Facultad/escuela
Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
Nombre de Curso
Licencia CC
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Resumen
La Riboquinasa humana (RK) es miembro de la Superfamilia riboquinasa y cataliza la
fosforilación de D-ribosa en presencia de [MgATP] dando como producto D-ribosa-5-P, el
cual es un importante metabolito en la ruta de las pentosas-P. Interesantemente, la actividad
de esta enzima es estimulada por fosfato.
Para evaluar la presencia de determinantes estructurales involucrados en la unión del
nucleótido a la riboquinasa, realizamos alineamientos de varias secuencias aminoacídicas
conocidas de diferentes especies, encontrando la presencia de un residuo conservado de
treonina (235) localizado en el sitio activo. El papel de este residuo en la catálisis y
regulación de la riboquinasa humana fue evaluado por mutagénesis sitio-dirigida, para lo
cual se construyeron las mutantes T235S y T235I.
Ambas mutantes generaron cuerpos de inclusión y solo la enzima T235S pudo expresarse
de manera soluble. Esta mutante fue purificada a homogeneidad aunque con rendimiento
inferior a la purificación de la enzima silvestre.
La caracterización cinética de T235S no muestra cambios significativos en los parámetros
cinéticos en ausencia de fosfato. Sorprendentemente, la KM para MgATP y ribosa
incrementa 8 y 3 veces respectivamente en presencia de fosfato, sin cambios significativos
en la Además esta mutante no muestra activación por fosfato.
Estudiamos también los determinantes de unión a nucleótido por ensayos de fluorescencia,
caracterizando la unión de MgATP así como la de GTP, CTP y UTP. Para la enzima
silvestre la Kd para MgGTP es 20 veces más pequeña que la determinada para MgATP. Finalmente investigamos la interacción entre la enzima silvestre y análogos fluorescente
de ATP modificados en la región del azúcar presente en el nucleótido, TNP-ATP y MantATP. Los valores de Kd indican que la ribosa del nucleótido no participa
significativamente en la unión al sitio activo. Estos resultados indican que T235S puede
estar involucrada en el plegamiento y activación de RK por fosfato; en tanto que los
resultados de fluorescencia indican que la parte de la ribosa del nucleótido no se encuentra
directamente involucrada en la unión al sitio activo.
Human ribokinase (RK) belongs to the ribokinase superfamily and catalyzes D-ribose phosphorylation in presence of [MgATP] to yield D-ribose-5-P, which is an important metabolite in the pentose-P pathway. Interestingly RK is activated by phosphate. We determined the presence of conserved threonine (T235) located at the active-site. Evaluated the role of this Threonine using site-directed mutagenesis (T235S and T235I). Both mutants formed inclusion bodies and only T235S was found soluble with purification yields lower than the wild enzyme. Kinetic characterization of T235S showed no significant changes in kinetic parameters to be evaluated in the absence of phosphate. Surprisingly, the KM for MgATP and ribose increased 8 and 3 times, respectively, in presence of phosphate, without significant changes in kit, missing phosphate activation. We also study the structural determinants for nucleotide binding by fluorescence measurements. We evaluate MgATP binding as well as GTP, CTP and UTP. In the wild type enzyme, Kd for MgGTP is 20 times lower than the one determined for MgATP. Finally, we investigated the interaction between the wild-type enzyme and TNP-ATP and Mant-ATP; Kd values indicate that the ribose motif of the .nucleotide does not participate significantly in binding at the active site. These results indicate that T235 could be involved in the folding and phosphate activation of human RK; and the fluorescence results indicate that ribose is not directly involved in nucleotide binding to active site.
Human ribokinase (RK) belongs to the ribokinase superfamily and catalyzes D-ribose phosphorylation in presence of [MgATP] to yield D-ribose-5-P, which is an important metabolite in the pentose-P pathway. Interestingly RK is activated by phosphate. We determined the presence of conserved threonine (T235) located at the active-site. Evaluated the role of this Threonine using site-directed mutagenesis (T235S and T235I). Both mutants formed inclusion bodies and only T235S was found soluble with purification yields lower than the wild enzyme. Kinetic characterization of T235S showed no significant changes in kinetic parameters to be evaluated in the absence of phosphate. Surprisingly, the KM for MgATP and ribose increased 8 and 3 times, respectively, in presence of phosphate, without significant changes in kit, missing phosphate activation. We also study the structural determinants for nucleotide binding by fluorescence measurements. We evaluate MgATP binding as well as GTP, CTP and UTP. In the wild type enzyme, Kd for MgGTP is 20 times lower than the one determined for MgATP. Finally, we investigated the interaction between the wild-type enzyme and TNP-ATP and Mant-ATP; Kd values indicate that the ribose motif of the .nucleotide does not participate significantly in binding at the active site. These results indicate that T235 could be involved in the folding and phosphate activation of human RK; and the fluorescence results indicate that ribose is not directly involved in nucleotide binding to active site.
Notas
Tesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)
Esta Tesis fue financiada por el proyecto FONDECYT 1110137: "Evolution of Ribokinase superfamily enzymes: structure-function relationships that determine substrate specificity, metal assisted mechanism and protein stability".
Esta Tesis fue financiada por el proyecto FONDECYT 1110137: "Evolution of Ribokinase superfamily enzymes: structure-function relationships that determine substrate specificity, metal assisted mechanism and protein stability".
Palabras clave
Riboquinasa Humana, Nucleótidos