Caracterización de la biología molecular de la oligomerización de la proteína rica en cisteína CdeC del exosporium de Clostridioides difficil
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Fecha
2020
Profesor/a Guía
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Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
Clostridioides difficile es un bacilo Gram-positivo, anaerobio estricto, formador de endoesporas y productor
de toxinas (TcdA y TcdB) que se ha establecido como una de las principales causas de diarrea nosocominal
asociada a antibióticos. El exosporium es la capa más externa de las esporas de C. difficile, y juega un rol
en la interacción entre la espora y las células epiteliales del intestino en el hospedero. Se ha identificado la
proteína rica en cisteína CdeC como factor morfogénico del correcto ensamblaje del exosporium. Estudios
han evidenciado que CdeC forma especies multiméricas al analizar extractos de esporas de C. difficile y
proteína recombinante por western blot. Recientemente analizamos la expresión de CdeC en E. coli Shuffle
T7 por TEM, donde observamos que esta proteína se agrega en cuerpos de inclusión. Un análisis in silico
de la secuencia de CdeC reveló que tiene 5 motivos de secuencia repetida y que 3 de ellos son ricos en
cisteína, lo que sugiere que podrían tener un rol en su oligomerización. En base a estos antecedentes
caracterizamos la oligomerización de CdeC mediante una dinámica de expresión heteróloga de esta proteína
en E. coli a 21 y 37ºC durante diferentes periodos de tiempo. El análisis de la formación de oligómeros de
CdeC se realizó a partir de la fracción soluble e insoluble obtenida a cada tiempo de expresión por SDSPAGE y western blot. Este análisis evidenció que CdeC forma oligómeros de alto peso molecular en etapas
tempranas durante la expresión heteróloga en E. coli a 21 y 37ºC, pero estas especies están presentes en la
fracción insoluble. El análisis de la expresión heteróloga de CdeC en las cepas de E. coli BL21 (DE3) pRIL
y Shuffle T7, que se caracterizan por tener diferentes ambientes redox citoplasmáticos, reveló que proteína
puede formar oligómeros en ambos ambientes redox, pero que se encuentran presentas en la fracción
insoluble. Al analizar la expresión heteróloga de CdeC en E. coli BL21 (DE3) pRIL y Shuffle T7 por TEM
evidenció que esta proteína se agrega en cuerpos de inclusión en ambas cepas, pero en la cepa BL21 (DE3)
pRIL la proteína CdeC se agrega en cuerpos de inclusión que se caracterizan por tener una estructura
laminar. El tratamiento de los cuerpos de inclusión de CdeC con un agente reductor de puentes disulfuro
(DTT) produce la liberación de esta proteína recombinante agregada. El análisis de la expresión heteróloga
de las variantes truncadas de CdeC a 21 y 37ºC reveló que forman complejos de alto peso molecular. La
expresión heteróloga de M1-D100, M1-N214 y P206- R405 analizada por TEM evidenció que se agregan en cuerpos de inclusión que carecen de la estructura laminar presente en los cuerpos de inclusión de CdeC.
Los hallazgos obtenidos en este estudio determinan que momento durante la expresión heteróloga en E. coli
se forman los oligómeros de CdeC y el efecto de un agente reductor (DTT) en los cuerpos de inclusión de
esta proteína, pero aún desconocemos que región(nes) de la secuencia de CdeC estaría(n) involucrada(s) en
su oligomerización.
Notas
Tesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida)
Palabras clave
Biología Molecular, Proteínas, Clostridium Difficile