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Caracterización estructural de la proteína LLP (lectin like protein) de Arabidopsis thaliana y análisis de su patrón de expresión en condiciones de estrés Biótico
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Fecha
2012
Autores
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Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
Las plantas desarrollan diversas respuestas de defensa frente a determinadas condiciones
de estrés. En caso del estrés biótico, causado por microorganismos, la resistencia o susceptibilidad
está determinada por la capacidad de la planta de reconocer estructuras propias del patógeno y
activar genes para evitar la enfermedad. Una de las hormonas involucradas en esta respuesta es el
ácido salicílico (SA). Esta fitohormona se encuentra involucrada en la activación de genes de
defensa, razón por la cual muchas investigaciones se centran en determinar el papel específico de
SA bajo este tipo de estrés.
Análisis transcriptómicos realizados en plantas de Arabidopsis thaliana sometidas a
tratamientos con SA revelan una alta activación del gen Lectin Like Protein (LLP), el cual no ha
sido asociado con alguna función biológica. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio
revelan que LLP se induce bajo condiciones de estrés biótico, específicamente frente a la
inoculación con la bacteria Pseudomonas syringae Avr-Rpml. Además, se determinó que la sobreexpresión
de LLP limita el crecimiento bacteriano de la cepa Avr-Rpml y un aumento de la muerte
celular en la planta en comparación con la planta silvestre, lo que indica su participación en la
respuesta de defensa. Por su parte, otros análisis sugieren que LLP sufriría modificaciones posttraduccionales,
del tipo N-glicosilación, las cuales contribuirían a su localización final. Por otro
lado, el análisis de plantas que sobre-expresan LLP indica que esta proteína se localiza en la
membrana plasmática de la célula, a pesar que en su estructura primaria no presenta dominios de
transmembrana.
Considerando los antecedentes expuestos anteriormente, el objetivo de este trabajo es
estudiar la estructura de la proteína LLP y su localización subcelular tras la inoculación con el
patógeno Pseudomonas syringae Avr-Rpml. Como primera aproximación, relacionada a la
caracterización estructural de, se utilizaron herramientas bioinformáticas de modelamiento proteico
por homología en base a la similitud aminoacídica con otras proteínas relacionadas y previamente
caracterizadas. Los resultados obtenidos indican que LLP pertenecería a la familia de las lectinas de
leguminosas, descritas como proteínas que unen carbohidratos, y adquiriría un plegamiento similar y
característico de este grupo. Este análisis también permitió identificar la posible región de unión y
reconocimiento a carbohidratos en LLP, además de posibles residuos no-canónicos involucrados en
esta interacción.
En paralelo, se determinó experimentalmente que LLP es una proteína glicosilada, a
través de ensayos de desglicosilación enzimática. Estos resultados, junto a la presencia de un
péptido señal sugieren que LLP se localizaría en la cara externa de la membrana plasmática,
orientada hacia el apoplasto de la célula vegetal. Epor otra parte, ensayos de separación de proteínas
de membrana indican que LLP se encontraría fuertemente unida a esta estructura, por un mecanismo
no identificado.
Finalmente, se determinó la localización subcelular y el patrón de acumulación espacial
de la proteína de fusión LLP-GFP en hojas de tabaco transformadas en forma transitoria, luego de la
inoculación con cepas bacterianas de P. syringae Avr-Rpml y con SA. En estos experimentos se
encontró a la proteína LLP-GFP principalmente en la periferia de la célula.
En suma, los resultados de esta tesis aportan a la determinación de la función biológica de
LLP y con ello contribuyen al conocimiento del proceso de defensa de la planta frente al estrés
biótico.
Plants have diverse defense responses against specific stress conditions. In biotic stress, which is caused by microorganisms, resistance or susceptibility is determined by the ability of plants to recognize pathogen structures and activate genes in order to avoid disease. One of the hormones involved in this response is salicylic acid (SA). This phytohormone allows defense gene activation. For this reason, researchers are trying to determine the specific role of SA under these conditions. Transcriptomic analyses in Arabidopsis thaliana under SA treatments have shown a high activation of the Lectin Like Pro te in (LLP) gene, which has no known biological function. Previous studies from our laboratory have demonstrated that LLP is induced under biotic stress, specifically under Pseudomonas syringae Avr-Rpml infiltration. Moreover, over-expression of LLP restricts bacterial growth of the Avr-Rpml strain and enhances plant cellular death compared with wild type lines, suggesting its participation in a SA-mediated plant defense response. Additionally, LLP may contain post-traduccional modifications. On the other hand, lines over-expressing LLP-GFP fusion protein show that this protein is located in the plasma membrane, even though non transmembrane domains seem to be present in its structure. Considering this evidence, the aim of this work is the study of LLP protein structure and to determine its subcellular location in bacterial inoculated tissues. As a first approach, related with LLP structural characterization, we modelled a probable tertiary structure based on homology amino acidic comparison to known and previously characterized proteins. The results obtained indicate that LLP belongs to the legume lectin family, described as a carbohydrate binding protein, and that LLP may adopt the characteristic legume lectin fold. This analysis also allowed the identification of a putative sugar-binding site in LLP and non canonic residues involved in carbohydrate interaction. Experimentally, it was demonstrated that LLP contains N-glycosylations by enzymatic deglycosylation assays. This result and the presence of a signa! peptide suggest that LLP in located at the outer plasma membrane space. On the other hand, membrane proteins association assays strongly suggest that LLP is highly attached to the plasma membrane, but the nature of this bond is not clear. Finally, we determined the subcellular and spatial localization of LLP-GFP fusion protein m the cell periphery using transgenic tobacco leaves after P. syringae A vr-Rpm 1 and SA inoculations. These results can contribute to understand the biological function of LLP and its role in plant defense responses.
Plants have diverse defense responses against specific stress conditions. In biotic stress, which is caused by microorganisms, resistance or susceptibility is determined by the ability of plants to recognize pathogen structures and activate genes in order to avoid disease. One of the hormones involved in this response is salicylic acid (SA). This phytohormone allows defense gene activation. For this reason, researchers are trying to determine the specific role of SA under these conditions. Transcriptomic analyses in Arabidopsis thaliana under SA treatments have shown a high activation of the Lectin Like Pro te in (LLP) gene, which has no known biological function. Previous studies from our laboratory have demonstrated that LLP is induced under biotic stress, specifically under Pseudomonas syringae Avr-Rpml infiltration. Moreover, over-expression of LLP restricts bacterial growth of the Avr-Rpml strain and enhances plant cellular death compared with wild type lines, suggesting its participation in a SA-mediated plant defense response. Additionally, LLP may contain post-traduccional modifications. On the other hand, lines over-expressing LLP-GFP fusion protein show that this protein is located in the plasma membrane, even though non transmembrane domains seem to be present in its structure. Considering this evidence, the aim of this work is the study of LLP protein structure and to determine its subcellular location in bacterial inoculated tissues. As a first approach, related with LLP structural characterization, we modelled a probable tertiary structure based on homology amino acidic comparison to known and previously characterized proteins. The results obtained indicate that LLP belongs to the legume lectin family, described as a carbohydrate binding protein, and that LLP may adopt the characteristic legume lectin fold. This analysis also allowed the identification of a putative sugar-binding site in LLP and non canonic residues involved in carbohydrate interaction. Experimentally, it was demonstrated that LLP contains N-glycosylations by enzymatic deglycosylation assays. This result and the presence of a signa! peptide suggest that LLP in located at the outer plasma membrane space. On the other hand, membrane proteins association assays strongly suggest that LLP is highly attached to the plasma membrane, but the nature of this bond is not clear. Finally, we determined the subcellular and spatial localization of LLP-GFP fusion protein m the cell periphery using transgenic tobacco leaves after P. syringae A vr-Rpm 1 and SA inoculations. These results can contribute to understand the biological function of LLP and its role in plant defense responses.
Notas
Tesis (Ingeniería en Biotecnología)
Palabras clave
Proteínas, Arabidopsis Thaliana, Estrés biótico, Plantas, Chile