Análisis funcional y estructural de los sitios de unión de ligandos en quinasas dependiente de ADP del dominio arquea : (thermococcus litoralis y pyrococcus furiosus)

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dc.contributor.advisorGuixé Leguia, Victoria
dc.contributor.authorOlate Lillo, Fernando Andrés
dc.contributor.editorFacultad de Ciencias de la Vida
dc.date.accessioned2024-10-04T13:33:15Z
dc.date.available2024-10-04T13:33:15Z
dc.date.issued2009
dc.descriptionTesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)
dc.description.abstractDentro de la Superfamilía Riboquinasa existe un grupo de quinasas dependientes de ADP de organismos hipertermófilos, entre las que se encuentran las glucoquinasas provenientes de las arqueas Pyrococcus furiosus y Thermococcus litoralis. Estas glucoquinasas catalizan la fosforilación de glucosa usando ADP como dador del grupo fosforito. Ambas enzimas presentan características bioquímicas similares como la termoestabilidad, la especificidad por el sustrato y el pH óptimo. Sin embargo, existen diferencias estructurales entre ambas, ya que la enzima de T. litoralis es un monómero con una masa molecular de 52 KDa, mientras que la enzima de P. furiosus tiene una masa molecular nativa de aproximadamente de 93 KDa y está compuesta de dos subunidades idénticas de 47 KDa, un enlace disulfuro entre las Cys95 de cada uno de los monómeros estabilizaría la estructura dimérica. En este trabajo, las enzimas de ambos microorganismos se purificaron a homogeneidad y se caracterizaron cinética y estructuralmente. A través de cromatografía de exclusión molecular se determinó el estado de agregación de ambas enzimas, el que no cambia en presencia de glucosa, ADP ó DTT. Ambas enzimas utilizan ADP, CDP, glucosa y manosa como sustrato en forma significativa, en tanto que ninguna de ellas reconoce al A TP como sustrato. La eficiencia catalítica para ADP, CDP y glucosa es 2, 1,7 y 3 veces mayor para la enzima de P. furiosus, respectivamente. La unión de los ligandos se determinó a través de microcentrifugación, ya que ambas enzimas poseen 4 triptófanos, pero estos aminoácidos no censan la unión de ADP o glucosa lo que no hace variar la fluorescencia. Las constantes de disociación para ADP (Ko) fueron de 42 y 75 μM y para glucosa de 0,54 y 0,47 mM para las enzimas de T. litoralis y P. furiosus respectivamente. Para la enzima de P. furiosus la constante de disociación para glucosa sólo se pudo determinar en presencia de AMP. Los resultados sugieren que ambas enzimas reconocen tanto purinas como pirimidinas y que la cantidad de grupos fosfatos es fundamental en el reconocimiento de este ligando. Además, de los experimentos de unión se predice un mecanismo de unión de sustratos de tipo ordenado para la ADP-GK de P. furiosus. Una de las explicaciones para la presencia de glucoquinasa dependiente de ADP es que el ADP muestra una mayor termoestabilidad que ATP, especialmente en la presencia de cationes divalentes. Otra explicación es que las reacciones anabólicas generan ADP, lo cual provee el sustrato para las quinasas dependiente de ADP, lo que permite la utilización de la glucosa en condiciones de baja carga de energía. Desde el punto de vista evolutivo, es importante el estudio comparativo de las propiedades funcionales y estructurales del sitio de unión del nucleótido a nivel de la superfamilia, porque permitirá definir si las propiedades que determinan la especificidad por el nucleótido son comunes entre las quinasas dependientes de ADP y las dependientes de ATP.
dc.identifier.urihttps://repositorio.unab.cl/handle/ria/60996
dc.language.isoes
dc.publisherUNAB
dc.subjectEnzimas
dc.subjectEnzima ligado
dc.subjectMicroorganismos
dc.titleAnálisis funcional y estructural de los sitios de unión de ligandos en quinasas dependiente de ADP del dominio arquea : (thermococcus litoralis y pyrococcus furiosus)
dc.typeTesis
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