Repositorio Institucional Académico. Universidad Andrés Bello. Chile

Examinando por Autor "Saavedra, Claudia"

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Caracterización bioquímica y funcional del sistema de dos componentes ArcAB de Salmonella enterica serovar Typhimurium en respuesta a condiciones de estrés oxidativo
(Universidad Andrés Bello, 2013) Morales Sierra, Eduardo Hugo; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas
Salmonella enterica serovar Typhimurium es una bacteria Gram-negativo, anaerobio facultativo y patógeno intracelular que genera fiebre entérica en el modelo murino. Una vez ingerida por vía oral atraviesa el intestino y es intemalizada por las células fagocíticas. En este lugar, es contenida en un ragosoma especializado denominado "vacuola contenedora de Salmonella", donde se encuentra con una serie de compuestos antimicrobianos incluyendo las especies reactivas de oxígeno (ROS). Para sobrevivir, la bacteria ha generado diversos mecanismos de defensa que incluyen modulación de la producción de ROS, su degradación directa y cambios en la permeabilidad de su membrana externa En este contexto, la expresión de diversos genes que codifican porinas se ve alterada en respuesta a ROS y adicionalmente presentan diversos sitios de unión para el regulador global ArcA. Esto nos llevó a la hipótesis de que "El sistema de dos componentes ArcAB detecta y responde a estres oxidativo en Salmonella enterica serovar Typhimurium y produce cambios en la expresión génica para su supervivencia". Mediante la medición de los niveles de transcrito de los genes ompD, ompW, ompSJ y ompS2 y ensayos de cambio en la movilidad electroforética se demostró que el sistema de dos componentes ArcAB modulaba su expresión de manera directa en respuesta a ROS. Una vez demostrado que el sistema participaba regulando la expresión génica en estas condiciones, se evaluaron cambios transcripcionales globales mediante hibridación en microarreglos. El análisis reveló que ArcA regula 58 genes en respuesta a H2O2 mientras ArcB 68 y que la regulación de cada miembro del sistema es independiente entre si ArcA regula la expresión de genes implicados en metabolismo central, síntesis de siderófoms, glutatión y nucleótidos. Por su parte, el rol de ArcB se asocia principalmente con 1a regulación de la expresión de genes implicados en la biosíntesis de aminoácidos. Análisis bioquímicos revelaron que AICA es requerido _para mantener un balance en los niveles de NADH, el pool de glutatión y los niveles de ROS intracelulares. Finalmente, la medición de los niveles · de transcrito de arcA y arcB y de sus productos génicos, además del uso de mutantes puntuales de ]a proteína AICA y AICB en los residuos implicados en la transferencia del grupo fosfato permitieron identificar los residuos necesarios para mediar· la resistencia a H2O2 por cada uno de los miembros del sistema.
Caracterización electrofisiológica de la proteína OmpW de salmonella entérica serovar typhimurium en bicapas de fosfolípidos
(Universidad Andrés Bello, 2009) Delgado Cortés, María Graciela; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Salud; Escuela de Bioquímica
La membrana externa de las bacterias Gram negativo constituye una barrera de permeabilidad selectiva que permite el intercambio de iones y nutrientes, la eliminación de productos de desechos y la restricción de la entrada de compuestos nocivos a la célula. Estos procesos están mediados por proteínas formadoras de poros (porinas). El gen omp W de Salmonella Typhimurium codifica para un canal catiónico no específico, el que es inducido in vivo por metil viológeno (MV), compuesto tóxico gatillador de la generación de superoxido intracelular. También este gen es requerido para la resistencia a MV en S. Typhimurium. Esto podría representar un mecanismo de resistencia a agentes generadores de estrés oxidativo. La estructura cristalográfica de Omp W muestra un canal hidrofóbico que forma un ,8-barril de 8 hebras. En esta tesis, OmpW de S. Typhimuirum fue clonada, sobreexpresada y purificada, luego de lo cual, se realizaron experimentos de canal único bajo distintas condiciones iónicas. Este canal muestra diferentes estados de conductancia con distintas amplitudes en presencia de K+ y/o Na+. Igualmente, los estados cinéticos en presencia de K+ y Na+ difieren entre si. Se observa una variedad de modos cinéticos con diferentes fracciones de tiempo abierto y amplitudes en Na+, con alta frecuencia respecto a la situación observada en K+. Finalmente, se analizaron las propiedades biofisicas de la porina Omp W en presencia del tóxico MV y se determinó exitosamente corrientes del compuesto a través de la proteína, demostrando que la sal tóxica puede ser transportada por el poro in vitro. Por otro lado, las tasas de incorporación de Omp W en la bicapa y la conductancia del poro, dependen del tipo de fosfolípido utilizado para fonnar la bicapa. Dado que las bacterias modifican la composición de fosfolípidos de su membrana de acuerdo a las condiciones ambientales, el rol de Omp W como un agente protector contra el estrés oxidativo, podría estar mediado por cambios en micro dominios lipídicos en la membrana externa.
Determinantes estructurales para el sitio de unión a nucleótido en riboquinasa de Homo sapiens
(Universidad Andrés Bello, 2012) León Mardones, Magaly Andrea; Guixé Leguia, Victoria; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica
La Riboquinasa humana (RK) es miembro de la Superfamilia riboquinasa y cataliza la fosforilación de D-ribosa en presencia de [MgATP] dando como producto D-ribosa-5-P, el cual es un importante metabolito en la ruta de las pentosas-P. Interesantemente, la actividad de esta enzima es estimulada por fosfato. Para evaluar la presencia de determinantes estructurales involucrados en la unión del nucleótido a la riboquinasa, realizamos alineamientos de varias secuencias aminoacídicas conocidas de diferentes especies, encontrando la presencia de un residuo conservado de treonina (235) localizado en el sitio activo. El papel de este residuo en la catálisis y regulación de la riboquinasa humana fue evaluado por mutagénesis sitio-dirigida, para lo cual se construyeron las mutantes T235S y T235I. Ambas mutantes generaron cuerpos de inclusión y solo la enzima T235S pudo expresarse de manera soluble. Esta mutante fue purificada a homogeneidad aunque con rendimiento inferior a la purificación de la enzima silvestre. La caracterización cinética de T235S no muestra cambios significativos en los parámetros cinéticos en ausencia de fosfato. Sorprendentemente, la KM para MgATP y ribosa incrementa 8 y 3 veces respectivamente en presencia de fosfato, sin cambios significativos en la Además esta mutante no muestra activación por fosfato. Estudiamos también los determinantes de unión a nucleótido por ensayos de fluorescencia, caracterizando la unión de MgATP así como la de GTP, CTP y UTP. Para la enzima silvestre la Kd para MgGTP es 20 veces más pequeña que la determinada para MgATP. Finalmente investigamos la interacción entre la enzima silvestre y análogos fluorescente de ATP modificados en la región del azúcar presente en el nucleótido, TNP-ATP y MantATP. Los valores de Kd indican que la ribosa del nucleótido no participa significativamente en la unión al sitio activo. Estos resultados indican que T235S puede estar involucrada en el plegamiento y activación de RK por fosfato; en tanto que los resultados de fluorescencia indican que la parte de la ribosa del nucleótido no se encuentra directamente involucrada en la unión al sitio activo.
Estudio comparativo de rusticianinas en microorganismos acidófilos/halotolerantes
(Universidad Andrés Bello, 2015) Lazcano Olmos, Marcelo; Holmes, David; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica
La biolixiviación representa una vía económica atractiva para recuperar cobre especialmente de minerales de baja ley. Chile es sin duda una potencia mundial en el desarrollo de la tecnología de biolixiviación. Sin embargo, un gran desafio para la industria de la biolixiviación es la dificultad de obtener el agua dulce requerida para este proceso. Esto también es un problema en otros países, como Australia, donde la biolixiviación es llevada a cabo en zonas áridas. Usar agua salina, particularmente agua derivada del océano, para reemplazar el agua dulce podría mitigar el problema. Sin embargo, muchos microorganismos usados en los procesos de biolixiviación convencional no crecen en condiciones salinas. Esta tesis explica cómo la rusticianina, una proteína clave de transferencia de electrones, es capaz de funcionar en bacterias tolerantes a sal (halotolerantes) como Acidihalobacter prosperus DSM 5130 y Acidiferrobacter murciensis SPIII/3. Una comparación bioinformática de las proteínas rusticianina de estas dos bacterias halófilicas con proteínas rusticianinas homólogas de microorganismos biolixiviantes no tolerante a sal como Acidithiobacillus ferrooxidans fue realizado con el fin de evaluar si habían cambios aminoacídicos y/o modificaciones estructurales que pudiesen ayudar a explicar la tolerancia de sal de rusticianinas en A. prosperus y A. murciensis. La investigación se realizó usando varios programas bioinformáticas disponibles en internet. RAST fue utilizado para anotar los genomas de A. prosperus y A. murciensis, permitiendo la predicción de genes codificantes de rusticianina y proteínas asociadas con el complejo rusticianina. Las proteínas predichas de estos genes fueron curadas a mano usando un número de programas para la predicción de propiedades de proteínas incluyendo BLAST, PFAM, TMMPRED y PSORT. MAFFT y MEGA fueron utilizados para construir árboles filogenéticos. Swiss-Model fue utilizado para crear modelos estructurales de las diferentes rusticianinas, las cuales fueron visualizadas con Swiss-PDBViewer. Se realizó una búsqueda, en bases de datos, de genomas de microorganismos que contengan genes codificadores de proteínas potencialmente oxidadoras de hierro, incluyendo la rusticianina. La búsqueda reveló dos organismos halotolerante similares a A. ferrooxidan A. prosperus y A. murciencis. En contraste con A. ferrooxidan que contiene solo una copia de rusticianina, A. prosperus y A. murciencis contienen dos y tres copias respectivamente. Una comparación del modelo de rusticianina, correspondiente a A. sugiere que las cinco rusticianinas de los halofilicos conservan el sitio de cobre involucrado en la transferencia de electrones, pero cada una de estas rusticianina muestra cambios aminoacídicos alrededor del sitio de unión a cobre, principalmente tienen una tendencia a aumentar los residuos cargados positivamente. Adicionalmente, un aumento de residuos cargados fue detectado en la superficie de estas proteínas. El modelo presentado sugiere cómo éstas modificaciones podrían estabilizar la msticianina en presencia de concentraciones altas de sal. El modelo presenta predicciones que se podrían comprobar en futuras investigaciones experimentales y allana el camino para una mayor investigación en la microbiología de biolixiviación en condiciones salinas.
Estudios de los factores sigma involucrados en la respuesta a estrés osmótico en aislados de Salmonella que permanecen en la línea de producción de una granja de pollos de la Región Metropolitana
(Universidad Andrés Bello, 2024) Salinas Barrera, Valentina Ignacia; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Vida
Salmonella es un patógeno bacteriano intracelular facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Se divide en dos familias: Salmonella enterica (S. enterica) y Salmonella bongori (S. bongori). S. enterica posee más de 2600 serovares caracterizados y es uno de los patógenos más relevantes en el área de investigación debido principalmente a su impacto en la salud de la población. Estas bacterias han desarrollado diversos mecanismos para adaptarse a condiciones de estrés. Dentro de estos mecanismos descritos se encuentra la adaptación a estrés ácido, estrés oxidativo y estrés osmótico, siendo los mecanismos de modulación génica, la principal estrategia de supervivencia. Estos sistemas de regulación molecular le permiten a Salmonella adaptarse a diversos ambientes y regular la expresión de determinados metabolitos para enfrentar condiciones adversas dentro y fuera del hospedero. Uno de los componentes más importantes en la respuesta génica de Salmonella son los denominados Factores Sigmas, que corresponden a proteínas con funciones reguladoras, y controlan numerosas funciones esenciales en bacterias, siendo la más importante, la eficiente y oportuna transcripción de genes de respuesta. En Salmonella se han descrito distintas familias de Factores Sigma (σ), como σE (σ24), σF (σ28), σH (σ32), σS (σ38) y σN (σ54), que participarían en la adaptación a diferentes tipos de estrés del tipo ácido, oxidativo y osmótico. En la problemática actual, uno de los focos de interés es la creciente prevalencia de Salmonella enterica serovar Infantis (S. Infantis) en granjas y criaderos de pollos, lo que provoca contaminación en líneas de producción avícola. La persistencia de este género en dichos procesos productivos, puede generarse debido al desarrollo de resistencia a determinados antibióticos y desinfectantes utilizados en la industria para combatir infecciones generadas en las diferentes etapas de la industria. Investigaciones recientes han identificado que se han desarrollado modelos basados en aprendizaje automatizado para la identificación de procesos implicados en resistencia patógena. Por otra parte, también se sabe que en modelos de estudio como Escherichia coli y Staphylococcus aureus se producen sustituciones aminoacídicas que alteran el rendimiento de la RNA polimerasa (RNAP), y como consecuencia la tasa transcripcional, afectando directamente la respuesta a tóxicos y condiciones adversas del entorno, convirtiéndolas en cepas más resistentes. A partir de estos antecedentes, la hipótesis planteada es que el desarrollo de un modelo bioinformático basado en aprendizaje automatizado permite la identificación de sitios promotores que son reconocidos por los Factores Sigma en respuesta al estrés osmótico, lo que contribuye a su permanencia en la línea de producción, en cepas de Salmonella Infantis aisladas de la granja avícola, de la RM. Para desarrollar este trabajo se realizó una investigación bioinformática que permita la obtención de un modelo que nos facilite la exploración de las secuencias promotoras de genes de respuesta a estrés osmótico presentes en S. Infantis, e identificar las posibles modificaciones en los motivos de unión. Para llevar a cabo esto, se utilizaron las secuencias de los genomas de aislados de S. Infantis de la línea de producción de una industria avícola de la RM, para posteriormente identificar los Factores Sigma presentes y la distribución que posean en su genoma. También se analizaron los genes involucrados en la respuesta a la resistencia osmótica, y a otros estreses, para tratar de identificar secuencias genómicas como motivos transcripcionales, operones, promotores y sus respectivos sitios de inicio de la transcripción. En particular se identificó la distribución de los factores sigmas codificados en los genes rpoE, rpoD, rpoH, rpoN, rpoS y fliA que responden al estrés osmótico de las cepas de S. Infantis SE016 y SE081. Se espera que esta información conduzca a la identificación precisa del sitio de inicio de la transcripción (+1) y sus promotores asociados. En una fase posterior de la investigación, se pretende identificar las secuencias específicas que nos permitan detectar las sustituciones nucleotídicas (SNPs) presentes en los promotores identificados de las cepas mencionadas. A partir de esta búsqueda, se obtuvo que los Factores Sigma presentan distancias filogenéticas estrechas entre los serovares de Salmonella, por lo tanto, se propuso enfocar el estudio solo en las regiones promotoras. El resultado obtenido fue la identificación de 4695 genes, y 903 operones pertenecientes a estos, identificados bajo la plataforma Operon Mapper, lo cual dio paso al escaneo del genoma y la posterior identificación de las cajas transcripcionales -10 y -35 perteneciente a cada gen regulado bajo el Factor Sigma S en estrés osmótico, en las cepas SE016 y SE081 de S. Infantis. En los ensayos realizados, se obtuvo que los genes adiA, ompW, cpxR, rpoS y osmB que responden frente a estrés osmótico se encuentran presentes en las cepas SE016 y SE081 pertenecientes a S. Infantis, en donde el gen rpoS logró ser insertado en un vector de clonamiento y su posterior inserción en cepas de E. coli, lo cual permitiría en ensayos futuros el análisis de expresión de los sitios promotores pertenecientes a los genes adiA, ompW, cpxR, y osmB, en conjunto con rpoS frente a estrés osmótico.
La expresión del canal iónico TRPM7 es modulada por estrés oxidativo generado en neuronas expuestas a lipopolisacárido
(Universidad Andrés Bello, 2011) Núñez Villena, Felipe Ignacio; Simon Pino, Felipe; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica
Las infecciones bacterianas del sistema nervioso se mantienen como una causa común de mortalidad debido a la ineficacia de las terapias farmacológicas actuales. Entre las infecciones causadas por bacterias Gram negativo, es ampliamente aceptado que las consecuencias fisiopatológicas son producidas principalmente por la acción del lipopolisácarido (LPS) en el sistema nervioso. En el sistema nervioso, es tradicionalmente aceptado que el efecto neurotóxico mediado por el LPS es debido a la previa activación de células microgliales, sin embargo, evidencia reciente sugiere que el LPS podría ejercer un efecto neurotóxico de manera directa, es decir, sin la necesidad de una previa activación de células gliales. Para evaluar los mecanismos implicados en la muerte neurona1 inducida por la exposición a LPS en ausencia de células gliales, se utilizaron dos modelos de estudio: 1- células PC12 diferenciadas y 2- Hippocampal primary neurons (HPNs) deprivadas de glia. Los resultados muestran que el LPS incrementa la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y aumenta la expresión del canal iónico TRPM7, proteína con un rol crítico y que está involucrada en la neurotoxicidad provocada por isquemia cerebral. Adicionalmente, utilizando concentraciones moderadas de peróxido de hidrógeno, células PC12 diferenciadas también aumentan la expresión de TRPM7. Para determinar si el aumento de las especies reactivas de oxígeno gatilla el aumento de la expresión de TRPM7, células PC12 diferenciadas fueron expuestas a DTT, un agente altamente reductor. El efecto reductor del DTT impidió el incremento de la expresión de TRPM7 por parte del LPS. Finalmente, células PC12 diferenciadas se expusieron a los inhibidores farmacológicos DPI, inhibidor no selectivo de la NAD(P)H y cheleritrina, inhibidor de la PKC para determinar las fuentes de ROS relacionadas con el aumento de la expresión de TRPM7. El efecto de estos inhibidores impidió el incremento de la expresión de TRPM7 mediada por LPS.
Funding the public systems for research and innovation in Latin-America: An essential tool to improve the prevention and healthcare
(Asociacion Colombiana de Infectologia, 2024) Correa, Maria Dolores; Delgado, Lucy Gabriela; Francia, Maria E.; Jokelainen, Pikka; Saavedra, Claudia; Rodriguez-Morales, Alfonso J.; Gonzalez, Angel; Alvarez, Carlos; Gomez-Marin, Jorge E.
La pandemia de la COVID-19 parecía haber dejado claro no sólo para los organismos gubernamentales, sino para la sociedad en su conjunto, la importancia de la ciencia1. Nuestra revista publicó varias editoriales explicando y fundamentando la necesidad de la autonomía sanitaria cuyo requisito principal es la existencia de un sistema científico sólido y establecido2–4. Un ejemplo claro fue la disponibilidad de vacunas para COVID-19, las cuales llegaron en tiempos di símiles por país y con retraso con respecto a los países que las desarrollaron; por supuesto, esas vacunas son producto de la ciencia de países que invierten significativamente en el sector5. No hubo ningún país en Latinoamérica que pudiera desarrollar una vacuna con mayor antelación, y los países que se beneficiaron primero fueron los países con mayor desarrollo científico5. Sin embargo, no fueron solo las vacunas pues también hubo dificultades importantes con reactivos de diagnóstico, respiradores y medicamentos6–8. Sin ninguna ambigüedad, esto demuestra nuestra incapacidad para resolver problemas críticos para la supervivencia de los habitantes de nuestros países.
El gen acr3 de Exiguobacterium sp. SH31 es capaz de generar un fenotipo resistente a As en conjunto con los genes del operón ars en Escherichia coli
(Universidad Andrés Bello, 2018) Gariazzo Palma, Valentina Andrea; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Vida
El salar de Huasco corresponde a un humedal salino del altiplano chileno, considerado una zona desafiante para el desarrollo de vida debido a sus características climáticas, geológicas y geográficas. El norte de Chile presenta una elevada riqueza mineral, fomentando las actividades relacionadas a la extracción de los mismos. La particularidad del conjunto de condiciones que pueden co-ocurrir en los nichos del altiplano chileno está evidenciada por la gran diversidad de microorganismos presentes y la capacidad de estos mismos de resistir o resistir estas extremas condiciones, lo que ha generado gran interés en la comunidad científica respecto al estudio los mecanismos moleculares de adaptación a ambientes extremos. Debido a la alta toxicidad de este metaloide y a la diversidad de microorganismos capaces de desarrollarse en su presencia, se ha considerado que estos, presentan potencial biotecnológico, particularmente en el tratamiento de aguas residuales y suelos contaminados. Entre las bacterias que han sido reportadas como resistentes a altas concentraciones de arsénico se encuentra el género Exiguobacterium, este ha sido aislado de una diversidad de ambientes extremos, incluyendo el altiplano andino, demostrando su plasticidad y adaptación. Una de las cepas más resistentes es la S17, aislada del altiplano argentino, en la cual fue reportada por primera vez la presencia del gen acr3 que codifica para una bomba accesoria de expulsión de As(III), sugiriendo que esta sería el responsable de la superior resistencia de esta cepa, con respecto a otras del género. Nuestro grupo de trabajo aisló la cepa Exiguobacterium sp. SH31 del Salar del Huasco que presenta un nivel equivalente de resistencia a As (III) y As(V) que la cepa S17. Estudios realizados con la cepa SH31 demostraron que también porta el gen acr3 y que este responde a la presencia de arsénico. El mecanismo más estudiado y frecuente a través del cual los microorganismos resisten la presencia de arsénico en su ambiente es la reducción del As(V) dada por la presencia y expresión del operón ars, basado en la arseniato reductasa (arsC) y la bomba de eflujo de As(III) (arsB). El requerimiento de este operón en la resistencia a arsénico, ha sido demostrado utilizando la cepa de Escherichia coli AW3110 que tiene delecionado el operón ars de Escherichia coli K-12. Entonces, considerando estos antecedentes, se propone demostrar la participación del gen acr3 de Exiguobacterium sp. SH31 en la resistencia a As y su posible efecto en conjunto con los genes del operón ars en la cepa Escherichia coli AW3110 hipersensible, mediante la expresión heteróloga de los genes de interés, mediante experimentos bioquímicos y moleculares.
Generación de las herramientas moleculares para el estudio de la participación del sistema de dos componentes ArcAB en la evasión del sistema inmune adaptativo de Salmonella Typhimurium
(Universidad Andrés Bello (Chile), 2019) Kruger Carrasco, Gabriel Ignacio; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Vida
El estudio de Salmonella Typhimurium a llevado a conocer una variedad de mecanismos moleculares con los que lograr sobrevivir a la acción de las células del sistema inmune, tales como, macrófagos neutrófilos y células dendríticas. También se han caracterizado mecanismos de resistencia y de evasión a la acción de presentación de antígenos por parte de las células dendríticas provocando la disminución de la activación de linfocitos, por ende, evadiendo a la respuesta inmunitaria del hospedero. A su vez, el sistema de dos componentes ArcAB ha sido vinculado con la regulación de los mecanismos de resistencia y de la regulación de la virulencia bacteriana, por lo que su participación en la capacidad de evasión de Salmonella al sistema inmune adaptativo del hospedero tiene mucha relevancia. Por lo que se diseñaron cepas de Salmonella Typhimurium 14028s para su estudio posterior, a través de una herramienta molecular utilizada para el estudio inmunológico de Salmonella y su interacción con células dendríticas y linfocitos T, que consiste en la expresión heteróloga de la proteína ovoalbúmina por parte de la bacteria y la utilización de linfocitos T antígeno-OVA específicos. Esta herramienta permitirá realizar un seguimiento de la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos T CD4+ y CD8+ durante la infección de Salmonella. La generación de las cepas mutantes fue demostrada por la capacidad de crecimiento en sus medio selección y la corroboración de la ausencia del gen mediante PCR, mientras que la expresión heteróloga de la proteína ovoalbúmina fue comprobada mediante inmunodetección, obteniendo en este trabajo cepas silvestre, mutantes en los genes arcA, arcB, arcAB y cepas mutantes para controles en los genes invA (capacidad de invasión) y slyA (regulación de virulencia) con la capacidad de expresar la proteína ovoalbúmina, obteniendo características que destacan por sobre otros diseños ya utilizados para el estudio inmunológico de interacción de Salmonella y células dendríticas con potencial biotecnológico.
Genetic characterization of salmonella infantis with multiple drug resistance profiles isolated from a poultry-farm in chile
(MDPI, 2021-11) Pardo Esté, Coral; Lorca, Diego; Castro Severyn, Juan; Krüger, Gabriel; Alvarez Thon, Luis; Zepeda, Phillippi; Sulbaran Bracho, Yoelvis; Hidalgo, Alejandro; Tello, Mario; Molina, Franck; Molina, Laurence; Remonsellez, Francisco; Castro Nallar, Eduardo; Saavedra, Claudia
Salmonella comprises over 2500 serotypes and foodborne contamination associated with this pathogen remains an important health concern worldwide. During the last decade, a shift in serotype prevalence has occurred as traditionally less prevalent serotypes are increasing in frequency of infections, especially those related to poultry meat contamination. S. Infantis is one of the major emerging serotypes, and these strains commonly display antimicrobial resistance and can persist despite cleaning protocols. Thus, this work aimed to isolate S. Infantis strains from a poultry meat farm in Santiago, Chile and to characterize genetic variations present in them. We determined their genomic and phenotypic profiles at different points along the production line. The results indicate that the strains encompass 853 polymorphic sites (core-SNPs) with isolates differing from one another by 0–347 core SNPs, suggesting variation among them; however, we found discrete correlations with the source of the sample in the production line. Furthermore, the pan-genome was composed of 4854 total gene clusters of which 2618 (53.9%) corresponds to the core-genome and only 181 (3.7%) are unique genes (those present in one particular strain). This preliminary analysis will enrich the surveillance of Salmonella, yet further studies are required to assess their evolution and phylogeny. © 2021 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland.
Identificación y caracterización del regulador de respuesta no canónico asociado al sensor quinasa ArcB de Salmonella enterica serovar Typhimurium en respuesta a peróxido de hidrógeno y en macrófagos murinos
(Universidad Andrés Bello, 2020) Briones González, Alan Cristóbal; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Vida
Los organismos deben detectar los cambios en sus entornos de manera rápida y coordinar una respuesta para permitir la adaptación y la supervivencia. Uno de estos organismos que enfrenta múltiples cambios en su estilo de vida es Salmonella enterica serovar Typhimurium, un patógeno Gram negativo que causa gastroenteritis severa en humanos y fiebre tifoidea en ratones. El ciclo de vida de Salmonella comienza en aguas y/o alimentos contaminados, donde los huéspedes se alimentan y permiten que Salmonella ingrese al sistema digestivo del huésped. En estos nuevos ambientes, Salmonella debe enfrentar las duras condiciones del estómago y luego del intestino delgado. A pesar de estas condiciones, Salmonella sobrevive e infecta la lámina basal del intestino delgado, donde enfrenta un nuevo desafío, el sistema inmune innato comandado principalmente por macrófagos. Estas células huésped fagocitan a Salmonella y tratan de eliminarla mediante el uso de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente mediante la producción de peróxido de hidrógeno (H202). Sin embargo, Salmonella tiene diferentes mecanismos que detectan y eliminan el H202 . Uno de estos mecanismos es mediante la detección de señales a través de los sistemas de dos componentes (TCS). Estos sistemas están compuestos por un sensor unido a membrana con función histidina quinasa (HQ) y un regulador de respuesta (RR) citoplasmático, el cual promueve cambios genéticos para una rápida adaptación. Uno de los TCS estudiados por nuestro grupo es el TCS ArcB/ArcA, que se vinculó para la adaptación de los niveles de oxigenación y más tarde para el estado redox bacteriano. La acción bioquímica de ArcA bajo estrés de H202 está bien estudiada, sin embargo, el mecanismo molecular de la función de ArcB está pobremente descrita. Además, algunos trabajos han sugerido que la transducción de señales en el TCS ArcB/ArcA no siempre funciona de forma canónica, lo que plantea la idea de una conversación cruzada con otros componentes de TCS. En este trabajo, identificamos el regulón ArcB en estrés por H202 en Salmonella, este HQ detecta y promueve una respuesta versátil entre las condiciones de aerobiosis y H202. Además, análisis transcriptómicos sugieren que este TCS se conversa de manera cruzada con otros componentes de TCS, específicamente, un(os) RR(s). Nuestros análisis identificaron tres RR que podrían modular las respuestas a la exposición a H202, que son los reguladores BaeR, BasR y KdpE. Además, ensayos moleculares y bioquímicos mediante qRT-PCR y Phos-tag™,- SDS - PAGE nos permitieron determinar que ArcB podría comunicarse con los reguladores BasR y KdpE tras la exposición al H202. Además, nuestra observación podrían correlacionarse con la infección de macrófagos. Los resultados obtenidos de este trabajo amplían el conocimiento de cómo funciona ArcB en condiciones de estrés oxidativo y aclaran algunos aspectos de la hipotética conversación cruzada, donde identificamos tres reguladores (BaeR, BasR y KdpE), que podrían conversar de manera cruzada con ArcB en Salmonella.
Physiological Performance and Biosorption Capacity of Exiguobacterium sp. SH31 Isolated from Poly-Extreme Salar de Huasco in the Chilean Altiplano: A Study on Rare-Earth Element Tolerance
(Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2024-01) Serrano, Genesis; Fortt, Jonathan; Castro-Severyn, Juan; Castillo, Rodrigo; Saavedra, Claudia; Krüger, Gabriel; Núñez, Claudia; Remonsellez, Francisco; Gallardo, Karem
Rare-earth elements (REEs) are crucial metals with limited global availability due to their indispensable role in various high-tech industries. As the demand for rare-earth elements continues to rise, there is a pressing need to develop sustainable methods for their recovery from secondary sources. Focusing on Exiguobacterium sp. SH31, this research investigates the impact of La, Eu, Gd, and Sm on its physiological performance and biosorption capacity. Tolerance was assessed at pHpzc from 7 to 8 with up to 1 mM rare-earth element concentrations. This study visualized the production of extracellular polymeric substances using Congo red assays and quantified them with ultraviolet–visible spectroscopy. Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy characterized the functional groups involved in metal interactions. The SH31 strain displayed significant rare-earth element tolerance, confirmed extracellular polymeric substance (EPS) production under all conditions, and increased production in the presence of Sm. Spectroscopy analysis revealed changes in wavelengths associated with OH and R-COO-, suggesting rare-earth element interactions. SH31 demonstrated efficient metal adsorption, with removal rates exceeding 75% at pHpzc 7 and over 95% at pHpzc 7.5 and 8. The calculated Qmax value for rare-earth element biosorption was approximately 23 mg/g, and Langmuir isotherm models effectively described metal sorption equilibria. Genomic exploration identified genes related to extracellular polymeric substance formation, providing insights into underlying mechanisms. This study presents the first evidence of efficient La, Eu, Gd, and Sm adsorption by SH31, emphasizing its potential significance in rare-earth element recovery. © 2023 by the authors.
Prospección de levaduras Antárticas para la biosíntesis de nanopartículas de CuInS2 a bajas temperaturas y su aplicación como otosensibilizadores en celdas solares
(Universidad Andrés Bello, 2020) Arriaza Echanes, Carolina del Carmen; Saavedra, Claudia; Calderón, Iván; Facultad de Ciencias de la Vida
Las síntesis de quantum dots (QDs) se realiza mayoritariamente por métodos químicos ó métodos biomiméticos (química suave). Sin embargo, en el último tiempo se han desarrollado métodos de síntesis que utilizan sistemas biológicos para la generación de nanomateriales. En los últimos años se han comenzado a sintetizar QDs mediante microorganismos extremófilos, proceso que confiere propiedades nuevas a este tipo de QDs, lo que abre un nuevo nicho a este tipo de síntesis. Un lugar donde se aíslan microorganismos extremófilos es el Glaciar Unión en Antártica, sitio con condiciones híper extremas como: bajas temperaturas (promedio anual -30ºC), ausencia de agua líquida, ciclos de luz y oscuridad prolongados existiendo en el verano luz solar las 24 horas. Dentro de los microorganismos que se utilizan en la biosíntesis, las levaduras son las menos reportadas. Dentro de estas, a la fecha la mayoría de los nanomateriales han sido sintetizados por S. cerevisiae. Por otro lado, los trabajos con las levaduras provenientes de la antártica son escasos por lo cual existe un espacio sin explotar en la biosíntesis de nanomateriales utilizando levaduras antárticas. Uno de los mayores inconvenientes en la biosíntesis de QDs es el uso de metales tóxicos como Cd, As, Te, etc. Es por esto, que cobra relevancia la síntesis de nanomateriales con metales menos tóxicos. En este sentido, las nanopartículas de CuInS2 utilizan metales con baja toxicidad y son de gran importancia por uso en optoelectrónica y celdas solares. Actualmente sólo se sintetizan por métodos químicos y por un método biomimético descrito por nuestro laboratorio. En este trabajo se aislaron tres levaduras desde muestras de suelo cercanas a la base científica Glaciar Unión, las cuales fueron caracterizadas genotípicamente (secuenciación del gen ribosomal 5,8S y sus ITS). De éstas se evaluó su capacidad para biosintetizar QDs de CuInS2 en diferentes condiciones. Obtuvimos un asilado denominado EH4L (Filobasidium stepposum) capaz de biosintetizar de forma extracelular nanopartículas de CuInS2, las cuales fueron caracterizadas espectroscópicamente determinándose un espectro de absorbancia con un peak a los 500 nm y emisión de fluorescencia sobre los 650 nm. Además, mediante DLS se determinó un tamaño promedio de 9 nm para las nanopartículas biosintetizadas. Se evaluó la fotoestabilidad de las nanopartículas biosintetizadas y se comparó con las nanopartículas de CuInS2 sintetizadas por métodos biomiméticos. Las nanopartículas biosintetizadas mantienen su emisión de fluorescencia al pasar los días, no así las sintetizadas por el método biomimético indicando una mayor fotoestabilidad. Además, se evaluó la capacidad de las nanopartículas biosintetizadas de actuar como fotosensibilizador en celdas solares, demostrando un aumento de la eficiencia de las celdas respecto a aquellas que no poseían un fotosensibilizador. En esta tesis se reporta por primera un protocolo de biosíntesis de QDs de CuInS2, siendo pionero en el uso de levaduras antárticas para biosíntetizar nanomateriales y su potencial uso como fotosensibilizadores en celdas solares.
La proteína Omp W de salmonella enterica serovar typhimurium es requerida en el mecanismo de resistencia y expulsión de tóxicos desde la bacteria
(Universidad Andrés Bello, 2008) Gil Michell, Fernando Rafael; Saavedra, Claudia;
El transporte a través de la membrana externa (ME) de bacterias Gram negativo ocurre vía proteínas denominadas genéricamente porinas. Estas se organizan como homotrímeros formando canales acuosos que permiten el paso de solutos hidrofilicos y de bajo peso molecular (< 600 Da), siendo el periplasma isoosmótico con el medio extracelular. Las porinas clásicas presentan entre 12 y 22 hebras tipo B que forman el barril, a diferencia de las porinas denominadas pequeñas, que presentan entre 8 y 10 hebras tipo B En 1988 Morimyo aisló y caracterizó mutantes de Escherichia coli sensibles a metil viológeno. La región del genoma de E. coli ( 4 kpb) que contenía estas mutaciones, ubicada entre el operón triptofano y el gen tonB, fue utilizada en un estudio comparativo de genomas y se encontró que presenta pocas variaciones en las diferentes cepas analizadas. Río abajo del gen tonB se localiza el gen ompW, que codifica para una proteína de membrana externa con características de porina pequeña. Resultados preliminares de nuestro laboratorio indican que al igual que ompD, el gen omp W de Salmonella enterica serovar Typhimurium estaría involucrado en la resistencia de esta bacteria al tóxico metil viológeno (MV) y permiten especular que OmpW podría funcionar en conjunto con SmvA en la expulsión de MV y/o de algún otro producto de desecho derivado del estrés oxidativo. Evidencias recientes muestran que OmpW de Vibrio cholerae no se comportaría como una porina clásica al no permitir el ingreso de azúcares en experimentos de hinchado de liposomas. Este resultado apoyaría la idea de la participación de OmpW en la expulsión de tóxicos, y no necesariamente en la entrada de sustratos. Con la finalidad de comparar la susceptibilidad de la cepa silvestre de S. Typhimurium y sus derivadas mutantes ompW, ompD y ompW ompD, se determinó su susceptibilidad a MV en placas de medio mínimo suplementado con glucosa. Al igual que el mutante AsmvA la cepa smvA ompW mostró una sensibilidad a MV 12 veces mayor que la cepa silvestre. La complementación del mutante doble con el plasmidio pTOPO-ompW mostró el mismo fenotipo que la mutante simple 8.smvA. La complementación de células AsmvA !:iomp W con el plasrnidio pGEMT-smvAR mostró una sensibilidad a MV 1,8 veces mayor en relación a la cepa silvestre. Estos resultados sugieren que la bomba SmvA utilizaría una vía dependiente de OmpW en la expulsión del tóxico...
Rol del sistema de dos componentes ArcAB en la supervivencia de Salmonella Typhimurium a las condiciones ambientales encontradas dentro de macrófagos, neutrófilos y en la evasión de la respuesta inmune adaptativa
(Universidad Andrés Bello, 2019) Pardo Esté, Coral; Saavedra, Claudia; Pacheco, Rodrigo; Facultad de Ciencias de la Vida
Durante su ciclo infectivo los patógenos utilizan varias estrategias que le permiten adaptarse a las diferentes condiciones a las que se enfrentan durante su ciclo infectivo dentro del hospedero. En este contexto, el sistema de dos componentes ArcAB es uno de los mecanismos que posee el patógeno bacteriano Salmone!la enterica serovar Typhimurium para responder de forma eficiente a condiciones cambiantes de oxígeno, lo que le permite a la bacteria adaptarse de manera eficaz. Particularmente, en esta investigación nos propusimos evaluar la participación que tiene ArcAB en la capacidad de supervivencia de la bacteria al ambiente intracelular, específicamente frente a Especies Reactivas de Oxígeno (ROS), así como también en la evasión de la respuesta inmune adaptativa. Para esto, se determinaron las condiciones asociadas a la presencia de ROS en las que la bacteria se encuentra dentro de los fagocitos. Posteriormente, evaluamos la intensidad del daño oxidativo intracelular, el cual está relacionado con la presencia del gen que codifica para el factor transcripcional ArcA en el genoma de la bacteria, así como también en la activación de la enzima mieloperoxidasa, la cual es la principal responsable de la producción de ROS dentro de los neutrófilos. Del mismo modo, determinamos que el factor transcripcional ArcA participa activamente en la modulación de la respuesta a nivel transcripcional de Salmone!la en la vacuola fagocítica. También encontramos que ArcA está involucrado en la defensa contra el daño oxidativo dado que regula genes claves que están relacionados con la virulencia y el metabolismo bacteriano, que son indispensables para la supervivencia de la bacteria. Por lo tanto, en conjunto estos resultados nos permiten afirmar que el sistema de dos componentes ArcAB es necesario para que Salmone!la Typhimurium sobreviva dentro de fagocitos como macrófagos y neutrófilos, a través de la modulación de su expresión génica eficiente frente a ROS. Así, estos resultados muestran el potencial que tiene ArcA como candidata para su utilización biotecnológica en la industria de producción de alimentos y la medicina aplicada. La utilización de cepas atenuadas de Salmone!la puede usarse como modelo para la generación de vacunas contra salmonelosis, una enfermedad con alta prevalencia en países en vías de desarrollo. Además, estas cepas también tienen el potencial de ser utilizadas como carriers en terapia sitio dirigida, en enfermedades crónicas o cáncer donde es necesario llevar moléculas a lugares específicos dentro del organismo.
Rol del sistema de dos componentes ArcAB en la supervivencia de Salmonella Typhimurium en la evasión de la respuesta inmune adaptativa
(Universidad Andrés Bello, 2020) Krüger Carrasco, Gabriel Ignacio; Saavedra, Claudia; Facultad de Ciencias de la Vida
El sistema de dos componentes ArcAB ha sido estudiado por nuestro laboratorio y se ha determinado su participación en varios procesos de importancia en Salmonella Typhimurium, principalmente al combatir y evadir la acción de fagocitos del sistema inmune innato durante su ciclo infectivo, sin embargo, aún no se ha dilucidado su participación contra el sistema inmune adaptativo. El sistema inmune adaptativo tiene como principal vinculante con el sistema innato a las células dendríticas. Estas células son presentadoras de antígeno profesionales, por lo cual, procesan al patógeno para posteriormente presentar el antígeno en los órganos linfáticos y así activar a los linfocitos T e iniciar la activación del sistema inmune adaptativo en el hospedero. Además, Salmonella Typhimurium posee la maquinaria molecular para evadir tanto el sistema inmune innato como el adaptativo para lograr la infección sistémica, pero en muchos puntos de esa evasión aún no se ha esclarecido el funcionamiento y los efectores participantes. En este contexto, el sistema de dos componentes ArcAB resalta como candidato, al participar en la supervivencia y evasión del sistema inmune innato, modulando la supervivencia y evasión del sistema inmune adaptativo. Por consiguiente, en este trabajo se evaluó la activación de linfocitos T, mediante ensayos de presentación de antígenos el cual utiliza como antígeno único, la proteína ovoalbúmina, que es detectada específicamente por linfocito T transgénicos OT-I y OT-II, para linfocitos T CD8+ y CD4+ respectivamente. Estos linfocitos son co-cultivadas con las células dendríticas para la presentación de antígenos y posterior cuantificación de su proliferación y producción de citoquinas de forma in vitro. Para la evaluación de la participación del sistema de dos componentes ArcAB, se generaron cepas mutantes de S. Typhimurium en cada uno de los genes del sistema y una doble mutante ΔarcA-ΔarcB para evaluar la ausencia del sistema completo. También se consideraron como controles mutantes en slyA, como control de virulencia y la mutante en invA como control de invasión celular. Estas mutantes fueron transformados con un plásmido que contiene el gen OVAL para la ovoalbúmina, bajo un promotor constitutivo. Los resultados obtenidos por las mutantes en el sistema de dos componentes fueron distintos entre cada tipo de linfocitos T, observándose una tendencia proliferativa en mutantes del sistema ArcAB en linfocitos CD4+ aun así no significativo, mientras que en linfocito CD8+ no hubo diferencias respecto al control con la cepa silvestre. En base a estos resultados el sistema de dos componentes ArcAB no estaría participando en las condiciones evaluadas de la capacidad de evasión al sistema inmune adaptativo. Pero, varios estudios han descrito otras estrategias de evasión que posee Salmonella Typhimurium en la que puede estar participando el sistema de dos componentes ArcAB, entre ellos están la inhibición por contacto en el cual un variado grupo de efectores participan de este mecanismo y otra forma de evadir es invadiendo linfocitos B en donde la isla de patogenicidad-1 posee un rol fundamental. Además, ArcA es modulador indirecto de la isla de patogenicidad-1 y pueda estar regulando este método de evasión. Finalmente, Salmonella posee varias estrategias de evasión a la respuesta inmune adaptativa en la cual no se descarta la participación del sistema de dos componentes ArcAB.

Examinando por Autor "Saavedra, Claudia"

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