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Ítem Aislamiento y caracterización del factor de transcripción ICE1 de Eucalyptus globulus(Universidad Andrés Bello, 2011) Rasmussen Poblete, Susana Alejandra; Krauskopf, Erwin; Valenzuela, PabloICE1 es un factor de transcripción que es activado en respuesta a condiciones de frío en plantas. Es considerado como el componente clave dentro de la cascada de señalización de frío, activando la respuesta mediada por los factores de transcripción de unión a e-repetidos (CBFs) y gatillando la expresión de los genes localizados río debajo de esta cascada. En esta tesis aislamos un cDNA que codifica para la proteína ICE1 de Eucalyptus g/obu/us (Eg/CE1) a partir de una librería de cDNA construida bajo condiciones de frío. La secuencia de cDNA posee un marco de lectura abierto de 1683 pb y codifica para una proteína de 560 aminoácidos, con un peso molecular estimado de 60,48 kDa y un pi calculado de 5,65. La comparación de la secuencia de cDNA con la obtenida a partir de DNA genómico demostró que Eg/CE1 no posee intrones, confirmándose la presencia de todos los dominios característicos de las proteínas ICE1 descritas actualmente. Adicionalmente, encontramos un dominio de activación extra, que probablemente aumenta la actividad del factor de transcripción EglCE1. Este dominio también está presente en proteínas ICE1 de otras especies de Eucalyptus. Ensayos de expresión transientes demostraron que EglCE1 es un factor de transcripción que se une a los promotores de genes CBF, de la misma forma que AtlCE1. EglCE1 es un regulador transcripcional, activando y reprimiendo los promotores de los genes CBFs en respuesta a bajas temperaturas. Los niveles de transcritos de Eg/CE1 aumentaron en respuesta a condiciones de frío y sequía. El análisis de expresión de los genes río abajo demostró que la abundancia relativa de los mRNA de EgCBF1 aumentó sólo en respuesta a bajas temperaturas y no fue detectado en condiciones de sequía. Por otro lado, la abundancia relativa del gen EgRD29B disminuyó en respuesta a bajas temperaturas y aumentó en respuesta a sequía. Por otro lado, los niveles de proteína EgICE1 no variaron en las mismas condiciones. Sin embargo, se demostró que EglCE1 se encuentra fosforilado tanto en frío, sequía y condiciones control. Proponemos que existen eventos de desfosforilación implicados en la regulación post-traduccional en respuesta a condiciones de estrés, pero estro debe ser determinado experimentalmenteÍtem Estudio de la regulación de la respuesta a proteínas mal plegadas (Unfolded Protein Response o UPR) por la vía de AKT(Universidad Andrés Bello, 2013) Pérez Munizaga, Daniela Andrea; Bernales, Sebastián; Valenzuela, Pablo; Facultad de Ciencias BiológicasLa respuesta a las proteínas mal plegadas (UPR) y la vía de señalización de AKT comparten varias funciones regulatorias, incluyendo control del metabolismo, traducción y destino celular. Ambas vías tienen la capacidad de determinar decisiones de viabilidad celular bajo condiciones específicas. Se sabe que el UPR promueve la supervivencia celular, en parte por la activación de la vía AKT. Esto plantea la interrogante de si, al contrario, la vía AKT es capaz de regular al UPR. Para ello, se utilizó una serie de moléculas pequeñas que modulan la vía PI 3K/AKT y se monitoreó la actividad de las tres ramas del UPR: PERK, TRE 1 y A TF6. Sorprendentemente, la droga antiproliferativa y antiviral, AKT-IV, induce de manera fuerte y sostenida las tres ramas del UPR. Por el contrario, los otros inhibidores de la vía de PI3 K/AKT: LY294002 y AKT-Vlll , no fueron capaces de activar el UPR. Nuestros resultados muestran que AKT-IV induce la rama de PERK en minutos, mientras que las ramas de IRE 1 y A TF6 requirieron horas. Dentro de la rama de PERK, nosotros encontramos que la inducción de la fosforilación de eiF2a por AKT-IV, requiere tanto de la presencia, como de la actividad de AKT. Es más, nuestros datos sugieren que PERK es un sustrato de AKT. Sin embargo, la activación de la rama de PERK por AKT-IV no dependería de la act vidad de PI3K o de la fosforil ación de AKT en S4 73, lo que sugiere que la activación de PERK es producida por una activación no convencional de AKT. Por otra parte, nosotros confirmamos datos de la literatura que indican que AKT -IV desencadena la muerte celular, y además encontramos que esta muerte es dependiente en gran medida de la presencia de PERK e IREl . Finalmente, nuestros resultados muestran que la activación de eiF2a inducida en condiciones de hipoxia requiere de AKT, proporcionando una condición fisiológicamente relevante para la interacción entre AKT y la rama PERK del UPR. Todos nuestro datos sugieren la vía de señalización de AKT controlan el destino celular a través del UPR.Ítem Generation and analysis of expressed sequence tags from Botrytis cinerea(Sociedad de Biología de Chile, 2006) Silva, Evelyn; Valdez, Jorge; Holmes, David; Shmaryahu, Amir; Valenzuela, PabloBotrytis cinerea is a filamentous plant pathogen of a wide range of plant species, and its infection may cause enormous damage both during plant growth and in the post-harvest phase. We have constructed a cDNA library from an isolate of B. cinerea and have sequenced 11,482 expressed sequence tags that were assembled into 1,003 contigs sequences and 3,032 singletons. Approximately 81% of the unigenes showed significant similarity to genes coding for proteins with known functions: more than 50% of the sequences code for genes involved in cellular metabolism, 12% for transport of metabolites, and approximately 10% for cellular organization. Other functional categories include responses to biotic and abiotic stimuli, cell communication, cell homeostasis, and cell development. We carried out pair-wise comparisons with fungal databases to determine the B. cinerea unisequence set with relevant similarity to genes in other fungal pathogenic counterparts. Among the 4,035 non-redundant B. cinerea unigenes, 1,338 (23%) have significant homology with Fusarium verticillioides unigenes. Similar values were obtained for Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus nidulans (22% and 24%, respectively). The lower percentages of homology were with Magnaporthe grisae and Neurospora crassa (13% and 19%, respectively). Several genes involved in putative and known fungal virulence and general pathogenicity were identified. The results provide important information for future research on this fungal pathogen.Ítem Identificación y análisis funcional de genes de etapas tempranas del ciclo biológico de botrytis cinerea(Universidad Andrés Bello, 2009) Silva Moreno, Evelyn; Valenzuela, PabloEl hongo Botrytis cinerea es uno de los principales problemas fitosanitarios de la industria hortofrutícola en Chile, causando importantes pérdidas económicas antes, durante y después de la cosecha en cultivos como vides, tomates, frutillas, arándanos, duraznos, etc. La infección comienza cuando las esporas se adhieren a la superficie de la planta donde germinan y forman la hifa de infección. Esta estructura es capaz de atravesar la cutícula e invadir al hospedero por degradación química de la pared celular mediante la producción de enzimas hidrolíticas que permiten la invasión y posterior colonización del tejido. En este trabajo se han caracterizado diferentes asilados de B. cinerea disponibles en el laboratorio, lo que permitió identificar aislados con diferentes grados de virulencia. Posteriormente, mediante la generación de una genoteca de ADNc y el uso de herramientas bioinformáticas, se identificó genes involucrados en etapas tempranas de la infección e importantes en la patogenicidad de B. cinerea. Adicionalmente, el diseño y análisis preliminar de expresión génica, mediante microarreglos, permitió la identificación de 171 genes específicos de la espora, 92 genes específicos de la germinación y 544 relacionados con el crecimiento de la hifa de B. cinerea. De un total de 180 genes ortólogos identificados, el 40% de ellos están involucrados en etapas iniciales como adhesión, conidiogénesis, germinación y crecimiento de la hifa. Algunos de estos genes se aislaron, clonaron y secuenciaron y se analizó su expresión. Entre estos, el gen hex-1 que codifica para la proteína principal del cuerpo de Woronin, presentó un patrón de expresión diferencial al comparar dos aislados con diferente velocidad de crecimiento. El análisis funcional de hex-1 permitió revelar su importancia como gen patogénico y sugirió una participación, no sólo en el crecimiento vegetativo sino también en la germinación y en la capacidad de establecer la infección por B. cinerea. Otro gen estudiado fue cox-5, el cual codifica para una subunidad de la citocromo C oxidasa. Análisis funcionales de cox-5 permitió identificar un fenotipo letal producto de la inactivación del gen. En virtud de lo anterior, la identificación y caracterización de hex-1 y cox-5 proporcionan dos nuevos blancos para desarrollar estrategias de defensa en la planta que apunte a inactivar la capacidad del hongo de crecer sobre superficies vegetales. En resumen, este trabajo representa un aporte importante al conocimiento de la maquinaría génica que dispone este patógeno para invadir su hospedero y define un importante inventario de genes de B. cinerea para futuros estudios acerca de la interacción planta-patógeno.Ítem Identificación y expresión de antígenos de streptococcus phocae en e. coli, y su ensayo como candidatos para una vacuna recombinante en salmón(Universidad Andrés Bello, 2007) Manosalva Contreras, Headdy; Valenzuela, Pablo; Wilhlem Bavestrelllo, Vivian; Facultad de Ciencias de la Vida; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaStreptococcus phocae es un patógeno emergente en la industria de la salmonicultura chilena. Este patógeno es el principal responsable del síndrome por cocáceas Gram positivas que afecta al salmón del Atlántico, causando importantes pérdidas económicas a las empresas. El control de esta enfermedad se basa actualmente en el uso de antibióticos, lo cual tiene un fuerte impacto ecológico, además de la problemática de comercializar salmones con trazas de antibióticos. Por lo tanto, en este trabajo se desarrolló como un método preventivo una vacuna experimental para salmones basada en una mezcla de antígenos recombinantes contra S. phocae. A partir de un salmón infectado se obtuvo un aislado bacteriano (Spl), identificado como S. phocae a través de la secuencia del gen de RNA ribosomal de 16s. En esta tesis se demostró que el patógeno es capaz de infectar salmones pre-smolt y smolt en agua temperada dulce o salobre a una temperatura óptima de 16OC. Además se obtuvo un segundo aislado (2868) a partir de un pez infectado con el aislado Spl, el cual fue más virulento, provocando tres veces más mortalidad en los peces que Spl en las mismas condiciones. Proteínas de S. phocae, cuyos ortólogos se localizan en la pared de especies de Streptococcus relacionados filogenéticamente con S. phocae, y confieren una determinada protección contra el correspondiente patógeno, fueron seleccionadas como potenciales candidatos para la vacuna experimental. Basándose en los dominios conservados de éstas, fueron diseñados partidores degenerados para amplificar las regiones codificantes de las chaperonas Hsp6O y Hsp70, Soda, los receptores de transportadores ABC de metales FebP y PsaA y las proteínas de superficie Sip y PrtS de S. phocae mediante PCR. Las regiones codificantes fueron clonadas en el vector de expresión bacteriano pET2la, lográndose una abundante expresión de las proteínas recombinantes en E. coli. El potencial antigénico de las proteínas fue evaluado in silico. Como resultado, Hsp70, PsaA, Sip y PrtS presentaron los más altos índices de antigenicidad. Esto fue confirmado experimentalmente. Salmones inmunizados con una mezcla de estas mismas proteínas mostraron una respuesta inmune humoral potenciada. Por lo tanto, la vacuna fue formulada con una mezcla de estas cuatro proteínas, extracto de E. coli y adyuvante de Freund incompleto. Alevines de salmón del Atlántico fueron vacunados con la preparación y desafiados en las condiciones óptimas de infección del patógeno, el desafío mostró una efectiva protección en salmón del Atlántico contra S. phocae, con un porcentaje relativo de sobrevivencia (RPS) de un 81%. Además, se demostró que el extracto de E. coli y el adyuvante de Freund incompleto presentes en la formulación multicomponente tienen un importante rol en la protección.Ítem Interferencia del ARN mitocondrial no codificante por lentivirus psuedotipificados(Universidad Andrés Bello, 2012) Varas Godoy, Manuel; Burzio, Luis O.; Valenzuela, PabloBurzio y colaboradores han descrito una familia de ARNs mitocondriales no codificantes (ARNmtnc) denominados ARNmtnc Sentido (ARNmtnc-S) y ARNmtnc Antisentido (ARNmtnc-AS) que se encuentran diferencialmente expresados en células normales y tumorales. Células normales en proliferación expresan altos niveles tanto del ARNmtnc-S como del ARNmtnc-AS. En contraste, células que no están en división expresan bajos niveles de ambos transcritos. Interesantemente, células tumorales expresan el ARNmtnc-S y disminuyen la expresión del ARNmtnc-S. Estas características son observadas tanto en células en cultivo como en biopsias de tejidos. Previamente, Burzio y colaboradores demostraron que la transfección transiente con oligonucleótidos complementarios a estos ARNmtnc induce muerte en diferentes tipos de células cancerígenas in vitro, pero no en células normales, dando la posibilidad de usar la interferencia de estos ARNs mitocondriales como un potencial tratamiento contra el cáncer. El objetivo de este estudio fue determinar si la administración in vivo de lentivirus que codifican shRNA (del inglés short hairpain RNA) dirigidos contra los ARNmtnc podría inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos animales de melanoma de ratón. Para esto se construyeron vectores lentivirales no-replicativos que codifican un shRNA contra los ARNmtnc (Lv-ARNmtnc) y luciferasa (Lv-Control) y su efecto fue evaluado in vitro por transducción de células de melanoma de ratón B16F10. Mediciones por PCR en tiempo real indican una disminución de aproximadamente 6 veces en la expresión del ARNmtnc-S y del ARNmtnc-AS en células transducidas con Lv-ARNmtnc en comparación a células transducidas con Lv-Control. Además, la transducción de Lv-ARNmtnc induce muerte celular apoptótica determinada por exposición en la superficie celular de fosfatidilserina y fragmentación del ADN. La capacidad de estos lentivirus para inhibir el crecimiento de tumores sólidos y metástasis de células de melanoma B16F10 fue evaluada in vivo. Ratones C57BLl6 a los cuales se les indujeron tumores subcutáneos con células B16F10 fueron tratados cada dos días con cinco inyecciones intratumorales de 4 x lo7 Lv-ARNmtnc o LV-Control en un volumen de 100 VI. Los ratones tratados con Lv-ARNmtnc mostraron una significativa disminución en el volumen tumoral comparado a ratones tratados con LV-Control observado hasta el día 20 post inoculación de las células. Para el ensayo de metástasis, ratones C57BLl6 fueron inyectados por vía intravenosa con células B16F10 y cuatro días después se les administraron cada tres días 4 inyecciones intravenosas de 5 x 10' Lv-ARNmtnc o Lv-Control en un volumen de 200 pl. Los ratones fueron sacrificados dos semanas después de la inyección de las células para el análisis de metástasis pulmonar. Los ratones tratados con Lv-ARNmtnc mostraron una significativa reducción en el número de focos metastásicos comparados a los ratones tratados con Lv-Control y también una reducción en el peso pulmonar. Tinción de secciones de tejido con hematoxilina-eosina indica que los pulmones de los ratones tratados con Lv-ARNmtnc presentan solo unos pocos nódulos. En contraste, los nódulos metastásicos ocupaban la mayoría del tejido pulmonar cuando los ratones fueron tratados con Lv-Control. Estos resultados sugieren que la administración intratumoral y sistémica de shRNA dirigidos a los ARNmtnc representan una promisoria estrategia hacia el desarrollo de una potencial terapia contra el cáncer.Ítem RNA de interferencia en nicotiana benthamiana como modelo para el desarrollo de plantas resistentes a virus(Universidad Andrés Bello, 2011) Bruno Urbina, Consuelo; Valenzuela, Pablo; Facultad de Ciencias Biológicas; Doctorado en BiotecnologíaRESUMEN: El cultivo de las vides es uno de los de mayor importancia económica para Chile, sin embargo, se ve afectado por numerosos factores, tanto bióticos como abióticos. Los virus se consideran entre los patógenos de mayor importancia para este cultivo y hasta el momento se han descrito más de 60 especies de virus que afectan vides. La mayoría de ellos se transmiten a través de vectores, como nemátodos o áfidos. Se piensa que las metodologías de propagación a través de estacas serían las responsables del incremento y amplia diseminación de estos virus en los últimos años. No existen antecedentes de resistencia natural en vides frente a la infección por virus y la búsqueda de nuevas variedades resistentes ha sido blanco de muchos esfuerzos en este campo de investigación. En este trabajo se describe el desarrollo de resistencia a virus de vides a través de la inducción de silenciamiento génico en plantas de tabaco. Consideramos de gran importancia trabajar con los virus más comunes en Chile, como son: Grapevine leafroll associated virus 2 y 3, Grapevine virus A, Grapevine fanleaf virus y Grapevine fleck virus, y utilizar secuencias de aislados chilenos para inducir el silenciamiento génico contra los virus. Se realizó un análisis de las secuencias disponibles, se utilizaron mayormente secuencias obtenidas en estudios previos en el laboratorio y se secuenciaron los virus de los que no se disponían secuencias de aislados locales. En este trabajo se presenta el caso de Grapevine fleck virus, para el cual se obtuvo la secuencia del 70% del genoma de un aislado chileno y los fragmentos codificantes para los dominios proteicos conservados de la replicasa viral para otros 3 aislados, con los que se analizó la variabilidad de este virus en Chile. En este trabajo, analizamos la capacidad de diferentes secuencias virales para gatillar el silenciamiento génico en plantas, y probamos la habilidad de algunas de ellas para inducir resistencia frente a la infección con el virus. Se eligieron fragmentos de las secuencias codificantes para proteínas esenciales para el virus, como proteínas de replicación, movimiento, cubierta y proteínas de shock térmico, de los diferentes virus. En este proceso de elección de las secuencias a utilizar para la inducción del silenciamiento génico, nos llamó particularmente la atención tres proteínas de Grapevine leafroll associated virus-3, las que no tienen función putativa asociada y basados principalmente en la similitud de la organización genómica de GLRaV-3 con virus de otra familia, planteamos la hipótesis de que pudieran actuar como supresores del silenciamiento génico. Se desarrolló análisis bioinformáticos para intentar proponer una función putativa para estas tres proteínas de GLRaV-3, los que arrojaron resultados significativos sólo para la proteína p19.6 de GLRaV-3, en la cual se identificó un putativo dominio de unión de RNA doble hebra del tipo arreglos de α-hélices, lo que sin embargo no nos permitió asociarle una putativa función por ser un dominio presente en...Ítem Transactivación de IRE1 y PERK por una molécula pequeña inhibidora de quinasa(Universidad Andrés Bello, 2013) Morales Soto, Marisol; Bernales, Sebastián; Valenzuela, PabloLas células eucariontes tienen la capacidad de responder a la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico a través de un mecanismo conocido como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). Dos de los tres sensores del UPR; IREl y PERK participan activamente en las decisiones de sobrevida y muerte celular, por lo que constituyen potenciales candidatos para blancos terapéuticos. Ambos sensores son proteínas quinasa y sus regiones luminales son altamente similares e intercambiables, lo que sugiere un mecanismo de activación común. IRE 1 además contiene un dominio endoribonucleasa yuxtapuesto al dominio quinasa. El uso del inhibidor de quinasa APY29, reveló que la ocupación de sitio ATP del dominio quinasa de IREl provoca un cambio conformacional que induce su transactivación y oligomerización, permitiendo así la activación de los dominios endon·ibonucleasa adyacentes. Recientemente se encontró que inhibidores de quinasa pueden actuar como agonistas de la actividad quinasa, al promover la transactivación y oligomerización. Dada la similitud en los mecanismos de activación entre IREl y PERK en esta tesis proponemos estudiar el efecto de análogos de APY29 sobre la actividad quinasa de PERK. Nuestros resultados indican que el análogo AM9 es más potente y selectivo que APY29 en la inducción de la actividad endoribonucleasa de IREl, tanto in vitro como en líneas celulares, y funciona promoviendo su transactivación y oligomerización. Este análogo además es capaz de unirse e inhibir la actividad quinasa de PERK in vitro. Sin embargo y de manera interesante, análisis en líneas celulares muestran que AM9 puede actuar, dependiendo de la concentración, como agonista y como un inhibidor de la actividad quinasa de PERK, mostrando una curva de activación tipo campana. Esto sugiere que PERK se activa por un mecanismo dependiente de transactivación y oligomerización. Nuestros resultados muestran que un mismo inhibidor de quinasa puede modular a dos de los tres sensores del UPR. Por otra parte, estos resultados demuestran que PERK es activable por inhibidores de quinasa, lo cual es importante de considerar durante el uso y diseño de drogas que apunten a este sensor del UPR.