Examinando por Autor "Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro"

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    Análisis del perfil de metilación de DNA en el genotipo F del virus de la hepatitis B
    (Universidad Andrés Bello, 2015) Flores León, Yvo; Loyola Pedevila, Alejandra; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias Biológicas
    El DNA circular covalentemente cerrado (cccDNA) del virus de la hepatitis B (HBV) es el causante de la persistencia viral en infecciones crónicas. Este cccDNA, organizado como un minicromosoma en el núcleo del hepatocito infectado, se encuentra metilado en sitios CpG en al menos dos de los diez genotipos de HBV descritos (genotipos A y D). Con el objetivo de identificar metilaciones de DNA en el genotipo de HBV prevalente en Chile (genotipo F), se utilizó un sistema de cultivo en células hepáticas humanas Huh7 transfectadas con el genoma viral. El cccDNA aislado se digirió con la enzima de restricción HpaII, sensible a metilación de DNA. Mediante PCR en tiempo real se determinó el Índice de Metilación (IM) en 3 sitios HpaII situados en la Isla CpG II (CpG II); Isla CpG III (CpG III) y dentro del ORF del gen S (CpG S). El IM de estos 3 sitios CpG sugiere que la molécula de cccDNA del genotipo F se encuentra metilada luego de 24 h post-transfección. Además, estudiamos la dinámica de la metilación del cccDNA, utilizando el inhibidor de DNA metiltransferasas procaína, el cual disminuyó el IM de los sitios CpG II y CpG S. Al utilizar inhibidores de enzimas que modifican la cromatina como es el butirato de sodio (un inhibidor de desacetilasas de histonas), y la pargilina (un inhibidor de la desmetilasa de histona H3, LSD1), se observó que el butirato de sodio aumentó significativamente el TM tanto en CpG II como en CpG III, mientras que, por el contrario, la pargilina no afectó la metilación del cccDNA. Por lo tanto, nuestro trabajo entrega evidencias del estado de metilación del intermediario de replicación del genotipo F de HBV. Lo anterior es un antecedente importante para investigar y entender la regulación de la transcripción y replicación de este virus hepatótropo.
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    Efecto de mutaciones en sitios potenciales de fosforilación del dominio de la polimerasa del virus de la hepatitis C en la replicación del genoma viral
    (Universidad Andrés Bello, 2015) Figueroa Figueroa, Daniella Ruth; Villanueva Arancibia, Rodrigo Alejandro; Facultad de Ciencias Biológicas
    La fosforilación es un mecanismo conocido de regulación de la actividad de diversas proteínas. Dentro de la amplia variedad de proteínas que pueden ser blanco de la acción de kinasas, se encuentran las RNA polimerasas de los virus de RNA de hebra positiva. Una de aquellas enzimas, la proteína NS5B, es la principal encargada de la replicación del genoma del virus de la hepatitis C (HCV). La evidencia sugiere que su actividad podría estar modulada de manera positiva por fosforilación y se ha propuesto anteriormente que los residuos de seria en las posiciones 46, 76, 84, 96, 99 y 112 podrían participar en aquella forma de regulación. Para estudiar lo anterior, se utilizaron replicones subgenómicos de HCV con mutaciones puntales en los residuos de seria señalados, para eliminar la posibilidad de fosforilación o para simular una fosforilación constitutiva en aquellas posiciones. El efecto de dichas mutaciones se analizó en el contexto de los niveles de replicación de los replicones subgenómicos en base ala formación de colonias celulares resistentes a G418 (marcador de resistencia otorgado por los replicones). Los resultados sugieren que las serinas en las posiciones 46, 76 y 99 podrían participar en la regulación de la actividad de NS5B mediante fosforilación. Además, es posible que la fosforilación tenga efectos opuestos dependiendo del residuo que se encuentre fosforilado, ya que la simulación de una fosforilación en las serinas 46 y 76 produce un aumento en los niveles de replicación de replicones subgenómicos, mientras la fosforilación del residuo 99 resulta en una disminución significativa en la replicación del replicón mutante.