Silenciamiento a larga distancia mediante microRNAs artificiales

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dc.contributor.advisorPrieto, Humberto
dc.contributor.authorQuiroz Larraín, Daniela
dc.contributor.editorFacultad de Ciencias Biológicas
dc.contributor.editorEscuela de Ingeniería en Biotecnología
dc.date.accessioned2017-10-24T20:57:24Z
dc.date.available2017-10-24T20:57:24Z
dc.date.issued2016
dc.descriptionTesis (Magíster en Biotecnología)es_CL
dc.descriptionEste trabajo de tesis fue financiado por el proyecto “BIOFRUTALES- MEJORAMIENTO GENÉTICO DE VIDES” PBCT. Código: 501775-46
dc.description.abstractLos micro RNAs (miRNAs) son moléculas de 21 ó 22 nucleótidos (nt) que dirigen el silenciamiento de un gen blanco produciendo un corte de su RNA mensajero o inhibiendo la expresión de éste. En plantas, cumplen un importante rol en diversos procesos del desarrollo, metabolismo y respuesta a estrés. Diversos estudios evidencian que el movimiento de ciertos miRNAs entre tejidos vegetales distantes ocurre, aunque también se ha descrito que algunos no poseen esta capacidad móvil. Con estas características, el silenciamiento génico mediante RNAs pequeños, incluyendo miRNAs, representa una herramienta biotecnológica relevante en áreas vinculadas al mejoramiento genético vegetal. En nuestro laboratorio se ha diseñado una estrategia sencilla de ensamblado de pre-miRNA artificial (amiRNA) utilizando un pre-miRNA endógeno de Vitis vinifera; este diseño ha permitido la expresión de un amiRNA funcional. Con la hipótesis de que este amiRNA es capaz de producir señales móviles, en la presente tesis se desarrollaron líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana expresando constitutivamente el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) y el amiRNA para silenciar dicho gen (amiRNA-GFP). Ambas líneas fueron utilizadas en experimentos de injertación recíproca. Resultados preliminares a las injertaciones, utilizando líneas doble transfomantes de N. benthamiana (miR+/GFP+), permitieron verificar un efectivo knockdown del gen blanco, lo que fue corroborado mediante análisis fenotípico vía microscopía, mostrando un descenso en la fluorescencia de las plantas re-transformadas. A nivel molecular preliminar, evaluaciones RT-PCR mostraron la expresión disminuida del gen GFP. Adicionalmente, un PCR de horquilla y la secuenciación masiva de RNAs pequeños de las líneas doble transgénicas generadas, permitieron detectar el miRNA artificial esperado, además de otras especies asociadas a éste, con tamaños entre 21 a 24-nt. Para evaluar la capacidad móvil del amiRNA-GFP, se injertaron las líneas GFP+ y miR+/GFP+, ya sea como portainjerto (pie) o como injerto (aéreo). Los resultados fenotípicos de estas plantas fueron analizados por microscopía de epifluorescencia y mostraron que existió una disminución de la fluorescencia verde de las plantas injertadas con plantas que expresaban el amiRNA-GFP, tanto al utilizar éstas como pie o como segmento aéreo; esto no fue observado en plantas GFP+ injertadas con los correspondierntes controles de plantas de Nicotiana no transgénicas (WT). Los resultados obtenidos indicarían que el silenciamiento de la expresión de GFP estaría mediado por un movimiento bidireccional del amiRNA-GFP diseñado, reforzando la eventual utilidad de esta herramienta en diversos estudios tanto básicos como aplicados.es_CL
dc.identifier.urihttp://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/4447
dc.language.isoeses_CL
dc.publisherUniversidad Andrés Belloes_CL
dc.subjectMicro RNAes_CL
dc.subjectMejoramiento de Plantases_CL
dc.subjectBiotecnología Vegetales_CL
dc.titleSilenciamiento a larga distancia mediante microRNAs artificialeses_CL
dc.typeTesises_CL
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