Detección de la expresión de RNAs no codificantes de Salmonella Typhimurium en líneas celulares, utilizando como herramienta el sistema CRISPR/Cas13a
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Fecha
2021
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Idioma
es
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Editor
Universidad Andrés Bello
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Licencia CC
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Resumen
S. Typhimurium es una bacteria Gram negativo capaz de generar enfermedades gastrointestinales en
humanos. Este patógeno es capaz de infectar diferentes tipos celulares dentro de los cuales sobrevive
regulando la expresión génica, lo cual puede ser utilizando RNAs pequeños no codificantes (sRNAs) que
actúan mediante apareamiento con mRNAs blancos. Existen diversos sRNAs que podrían estar relacionados
con procesos de virulencia como invasión, proliferación o la capacidad de Salmonella de persistir en células
como macrófagos, fibroblastos, células epiteliales y/o células dendríticas. Para analizar la participación de
estos sRNAs en distintas etapas de infección y tipos celulares que Salmonella enfrenta, estostranscritos deben
ser detectados. Para esto existen estrategias experimentales que nos permiten detectar estas moléculas, pero
muchas de éstas requieren varios pasos sucesivos y diversos equipos, implicando así gran manipulación de
las muestras, lo que en el caso de un sRNA es particularmente importante ya que son moléculas muy lábiles
y propensas a degradación. Por otro lado, en ciertas células existe una baja población bacteriana, producto
de la propia adaptación del patógeno a dicho ambiente, dificultando en cierta medida la detección de sRNAs,
producto del poco material de partida. Estas condiciones nos llevan a proponer una herramienta molecular
de detección basada en el sistema de defensa bacteriano CRISPR/Cas13a, que detecte de forma simple y
específica un determinado sRNA mediante apareamiento de bases con un CRISPR RNA (crRNA)
complementario. Para el CRISPR/Cas13a, se sabe que el apareamiento de un crRNA con su RNA blanco
específico, acciona la actividad RNAsa colateral de Cas13. Esta propiedad puede ser aprovechada
biotecnológicamente para un sistema de detección de un transcrito específico, ya que Cas13a puede degradar
inespecíficamente RNAsreporteros presentes en el medio, modificados con un sistema quencher-fluorósforo,
provocando así una emisión de florescencia. En el presente trabajo se hipotetiza que es posible detectar de
forma específica un sRNA de S. Typhimurium desde bacterias intracelulares con este sistema CRISPR/Cas13a.
Utilizando como modelo el sRNA IsrG (pre-identificado como marcador de infección) y líneas celulares como
macrófagos, células epiteliales y fibroblastos, se generó un sistema de detección in vitro basado en la proteína
Cas13 y un crRNA específico para el sRNA IsrG. La emisión de fluorescencia observada en nuestro ensayo,
además de evidenciar la detección específica del sRNA IsrG y con una sensibilidad del orden de los 3 µg,
permitió validar la técnica para detectar transcritos desde bacterias intracelulares.
Notas
Tesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida)
Palabras clave
Salmonella Typhi, Investigaciones