Detección de la expresión de RNAs no codificantes de Salmonella Typhimurium en líneas celulares, utilizando como herramienta el sistema CRISPR/Cas13a
dc.contributor.advisor | Calderón, Iván | |
dc.contributor.advisor | Acuña Olivares, Lilian | |
dc.contributor.author | Montt Cartes, Fernanda | |
dc.contributor.editor | Facultad de Ciencias de la Vida | |
dc.date.accessioned | 2021-07-24T17:34:30Z | |
dc.date.available | 2021-07-24T17:34:30Z | |
dc.date.issued | 2021 | |
dc.description | Tesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida) | es |
dc.description.abstract | S. Typhimurium es una bacteria Gram negativo capaz de generar enfermedades gastrointestinales en humanos. Este patógeno es capaz de infectar diferentes tipos celulares dentro de los cuales sobrevive regulando la expresión génica, lo cual puede ser utilizando RNAs pequeños no codificantes (sRNAs) que actúan mediante apareamiento con mRNAs blancos. Existen diversos sRNAs que podrían estar relacionados con procesos de virulencia como invasión, proliferación o la capacidad de Salmonella de persistir en células como macrófagos, fibroblastos, células epiteliales y/o células dendríticas. Para analizar la participación de estos sRNAs en distintas etapas de infección y tipos celulares que Salmonella enfrenta, estostranscritos deben ser detectados. Para esto existen estrategias experimentales que nos permiten detectar estas moléculas, pero muchas de éstas requieren varios pasos sucesivos y diversos equipos, implicando así gran manipulación de las muestras, lo que en el caso de un sRNA es particularmente importante ya que son moléculas muy lábiles y propensas a degradación. Por otro lado, en ciertas células existe una baja población bacteriana, producto de la propia adaptación del patógeno a dicho ambiente, dificultando en cierta medida la detección de sRNAs, producto del poco material de partida. Estas condiciones nos llevan a proponer una herramienta molecular de detección basada en el sistema de defensa bacteriano CRISPR/Cas13a, que detecte de forma simple y específica un determinado sRNA mediante apareamiento de bases con un CRISPR RNA (crRNA) complementario. Para el CRISPR/Cas13a, se sabe que el apareamiento de un crRNA con su RNA blanco específico, acciona la actividad RNAsa colateral de Cas13. Esta propiedad puede ser aprovechada biotecnológicamente para un sistema de detección de un transcrito específico, ya que Cas13a puede degradar inespecíficamente RNAsreporteros presentes en el medio, modificados con un sistema quencher-fluorósforo, provocando así una emisión de florescencia. En el presente trabajo se hipotetiza que es posible detectar de forma específica un sRNA de S. Typhimurium desde bacterias intracelulares con este sistema CRISPR/Cas13a. Utilizando como modelo el sRNA IsrG (pre-identificado como marcador de infección) y líneas celulares como macrófagos, células epiteliales y fibroblastos, se generó un sistema de detección in vitro basado en la proteína Cas13 y un crRNA específico para el sRNA IsrG. La emisión de fluorescencia observada en nuestro ensayo, además de evidenciar la detección específica del sRNA IsrG y con una sensibilidad del orden de los 3 µg, permitió validar la técnica para detectar transcritos desde bacterias intracelulares. | es |
dc.identifier.uri | http://repositorio.unab.cl/xmlui/handle/ria/19488 | |
dc.language.iso | es | es |
dc.publisher | Universidad Andrés Bello | es |
dc.subject | Salmonella Typhi | es |
dc.subject | Investigaciones | es |
dc.title | Detección de la expresión de RNAs no codificantes de Salmonella Typhimurium en líneas celulares, utilizando como herramienta el sistema CRISPR/Cas13a | es |
dc.type | Tesis | es |
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