Caracterización del gen pelado durante el desarrollo embrionario de pez cebra

Abstract

El gen pelado se ha identificado en los organismos invertebrados Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans;; se encuentra conservado hasta mamíferos superiores como humanos. Estudios funcionales realizados en ambos invertebrados mediante el knockout del gen, han reportado que su función estaría relacionada al proceso de neurogénesis En C.elegans, se ha observado que su falta de función afecta el correcto proceso de neurogénesis, lo cual también se ha observado en D. melanogaster. Con el objetivo de hacer extensiva la caracterización de este gen a organismos vertebrados, un trabajo previo a esta tesis, evaluó la posible función de pelado en el proceso de neurogénesis del pez cebra. Para ello, utilizó como modelo la línea lateral y se determinó que la falta de función de pelado no afecta el proceso de neurogénesis en la línea lateral, sin embargo, provoca defectos en su formación. Esta tesis propuso dilucidar la función del gen pelado sobre el primordio migratorio del pez cebra, estructura encargada de dar origen a la línea lateral posterior. Para caracterizar la función de este gen, utilizamos morfolinos antisentidos en embriones silvestres y en líneas transgénicas que presentan marcado con fluorescencia las diferentes estructuras de la línea lateral. Nuestros resultados muestran que pelado se expresa desde 0hpf hasta estadios larvarios, en particular en el cerebro, tubo neural ventral y notocorda. El knockdown de pelado, genera una disminución del tamaño del primordio migratorio, dado por una disminución de la proliferación celular y un aumento de la muerte celular en la misma estructura. Sin embargo, el fenotipo del knockdown de pelado es reversible al bloquear la actividad de p53. De esta forma, el fenotipo de la falta de función de pelado mediante la microinyección de morfolinos, puede estar modulando la muerte celular a través de p53 o bien, ser inespecífico. En el último caso, ésta tesis sería el primer trabajo que demostraría que el uso de morfolinos podría inducir la activación de p53 de forma gradual, haciéndolo un excelente modelo de evaluación pre-­eliminar de morfolinos que no alcanzan el umbral suficiente de activación de p53 que genere defectos cráneo-­faciales, pero que si activarían de forma inespecífica la muerte celular en menor medida.

The pelado gene has been identified in both, Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans;; it is conserved until human. Functional studies performed on both invertebrates through gene knockout have reported that their function would be related to neurogenesis. In D. melanogaster, the knockout result present structural defects in the photoreceptors that form the eye, and in C. elegans, problems in the growth and migration of the axons of their motor neurons are observed. Aiming to extend the characterization of this gene to vertebrate organisms, a work prior to this thesis, evaluated the possible pelado function on the neurogenesis of Danio rerio (zebrafish). For this, the lateral line (mechanosensory organ) was used as model and it was determined that the knockdown of pelado does not affect the neurogenesis process in the lateral line, however, causes defects on it’s formation. This thesis proposed to elucidate the function of pelado gene over the migratory primordium in zebrafish, structure responsible of the formation of the posterior lateral line. To characterize the function of this gene, we used antisense morpholinos in wild embryos and in transgenic lines that fluorescently labeled the different structures of the lateral line (primordium and neuromasts). Our results show that pelado is expressed from 0hpf to larval stages, particularly in the brain, ventral neural tube and notochord. The knockdown of pelado, generates a smaller migratory primordium, given by a diminution of the cellular proliferation and an increase of the cellular death in the same structure. However, the knockdow phenotype of pelado is reversible by blocking p53 activity. Thus, the phenotype of the knockdown of pelado through the microinjection of morpholino, may be an artifact associated with the technique, or pelado indeed modulates cell death through p53. In the latter case, this thesis would be the first work that would demonstrate that the use of morpholinos could induce the activation of p53 gradually, making it an excellent model of pre-­elimination evaluation of morpholinos that do not reach the sufficient threshold of activation of p53 that produces craniofacial defects, but could activate nonspecific cell death to a lesser extent.