Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado
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Examinando Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado por Autor "Abarzúa Pastene, Sebastián Alejandro."
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Ítem Generación de superóxido en plasticidad estructural vía NMDA-NR2B/RasGRF1[NOX2 en neuronas in vitro(Universidad Andrés Bello, 2015) Abarzúa Pastene, Sebastián Alejandro.; Zundert, Brigitte van; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Bioquímica.La plasticidad neuronal es un término que define la capacidad de las neuronas para cambiar o reorganizar sus circuitos y funciones dependientes de actividad. Así, durante el desarrollo del cerebro la plasticidad estructural puede cambiar a través de un proceso denominado dendritogénesis. Es aceptado que este proceso incluye actividad sináptica mediada por el receptor N-metil D-aspartato (R-NMDA), un receptor ionotrópico que es activado por glutamato y que está compuesto típicamente por dos subunidades obligatorias NR1 y dos subunidades NR2A-D. Se ha demostrado que R-NMDA juega un rol fundamental en la organización estructural dependiente de actividad tanto in vivo como in vitro. Además, antecedentes de nuestro laboratorio señalan que la sobre expresión de la subunidad NR2B, y no NR2A, permite aumentar la arborización dendrítica en neuronas hipocampales (NHs) y neuronas de la médula espinal ventral (NMEVs), y que este aumento sólo es posible si el dominio C-terminal de NR2B está presente. De esta forma NR2B estaría modulando diferentes procesos celulares involucrados en plasticidad estructural. Además de la configuración del R-NMDAs, la asociación de éste con sus proteínas de anclaje o complejos de transducción de señales, también está involucrado en fenómenos de plasticidad. Por ejemplo, RasGRFI, uno de los factores intercambiadores del nucleótido guanina que facilita la liberación de GDP para unir GTP a la molécula efectora, se encuentra enriquecido en la sinapsis y ha sido descrito como regulador de la vía de señalización ERK1/2 dependiente de R-NMDA. La activación de RasGRFI se asocia también a un aumento de la dendritogénesis; esto es posible ya que posee un dominio de unión especifico a NR2B. Adicionalmente, está reportado que la estimulación del R-NMDA permite la generación de superóxido. En este contexto la enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa 2 (NOX2), es la principal fuente de superóxido (02) in vitro. No ha sido reportado cuál de las subunidades del R-NMDA, NRINR2B o NRINR2A, es la encargada de activar aNOX2, ni tampoco si el superóxido estaría modulando la dendritogénesis vía R-NMDANR2B/RasGRFl. Con el objetivo de evaluar la producción de superóxido se usó una sonda comercial que al ser oxidada específicamente por el superóxido emite una señal fluorescente. Para evaluar la importancia de la participación de las distintas subunidades del R-NMDA en la vía de señalización asociada a la producción de superóxido, se transfectaron NHs y en NMEVs con los constructos NR2B-BD y RasGRFl-BD. Finalmente se evaluó la contribución de la enzima NOX2 en la dinámica de dendritogénesis. Se encontró que los niveles de superóxido en las NHs varían durante su desarrollo. En neuronas en estadios de desarrollo intermedio (12 DIV) la producción de superóxido aumenta comparado con estadios maduros (18 -25 DIV). Esto mismo sucede al estimular el R-NMDA pero se observa sólo una disminución significativa en la producción de superóxido, cuando se utiliza el bloqueador de NOX2 a los 7 y 12 DIV. También encontramos que la interacción de NRINR2B con RasGRF1 es necesaria para la generación de superóxido a partir de NOX2. Además, al activar la vía NMDA-NR2B/RasGRFl y bloquear la NOX 2 con apocinina se genera la retracción de los procesos dendríticos, indicando que la generación de superóxido vía NMDA-NR2B/RasGRFl/NOX2 permite modular la dendritogénesis en NHs y NMEVs in vitro.