FM - Trabajos de Titulación Post-Grado

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Examinando FM - Trabajos de Titulación Post-Grado por Autor "Allende, Miguel"

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    Identificación de Linfocitos B en pez cebra
    (Universidad Andrés Bello, 2013) Rubio Ahumada, Solange; Rosemblatt, Mario; Allende, Miguel; Wilhelm, Vivian
    El pez cebra como modelo ofrece diversas ventajas para el estudio del sistema inmune tanto innato como adquirido entre las que se cuentan su transparencia en los estadios iniciales del desarrollo, fácil manipulación y la disponibilidad de poderosas metodologías genéticas y moleculares. Se ha descrito que los peces poseen células con características similares a los linfocitos B y T de otros vertebrados. Dadas las ventajas mencionadas, el pez cebra es un buen modelo para estudiar estas poblaciones linfoides. Sin embargo, un inconveniente importante en este campo es la falta de herramientas inmunológicas tales como anticuerpos monoclonales que permitan aislar diferentes linajes linfoides y así poder caracterizar estos componentes celulares del sistema inmune de teleósteos. Aunque, aparentemente, muchos de los elementos esenciales del sistema inmune adquirido entre mamíferos y teleósteos son conservados, existen diferencias entre ellos, como la ausencia de médula ósea en los peces, cuya función como órgano hematopoyético en mamíferos, es desempeñada por el riñón en los teleósteos. Es en el riñón donde podemos encontrar linajes hematopoyéticos similares a los de médula ósea de mamíferos. Por otro lado y en contraste a lo que ocurre en mamíferos, los peces tienen sólo cuatro tipos de inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgZ e IgT. Entre estas, la IgM es la única que desempeña un papel importante en la respuesta inmune humoral de los teleósteos. Además de ser la inmunoglobulina más abundante en el suero de los peces, se encuentra presente en la superficie celular de los linfocitos B, lo cual permite usarla como marcador para esta subpoblación linfoide. A pesar de los antecedentes descritos, los linfocitos B de teleósteos están pobremente caracterizados, por lo cual, el objetivo de este trabajo fue avanzar en la caracterización de los linfocitos B en el pez cebra. Para ello utilizamos un anticuerpo monoclonal anti-IgM de salmónido, preparado previamente y establecimos que reconoce esta inmunoglobulina también en pez cebra. Por otro lado, aprovechamos la isponibilidad de distintas líneas de pez cebra transgénicas, entre ellas: rag2::GFP, que permite identificar linfocitos inmaduros, mhc2dab::GFP que marca células presentadoras de antígeno y cd45::DsRed, que marca una subpoblación de células mieloides y linfocitos T. Con estas herramientas, separamos las distintas subpoblaciones linfoides, mediante cell sorting y analizamos, a través de PCR en tiempo real, la expresión de los marcadores linfoides IgM, pax5 (gen clave en la diferenciación del linaje B), rag2 (determinante en el proceso de recombinación génica en linfocitos B y T) y Ick (codifica para una kinasa presente sólo en linaje T). Finalmente, aislamos las células I~My+ a nalizamos la habilidad de estas células de fagocitar material inerte y bacterias. En este estudio se logró identificar células I~M' en riñón, bazo y sangre de peces cebra adultos. Mediante citometría, demostramos que alrededor del 4% de todas las células renales presentan la expresión de IgM en la superficie celular. Estas células constituyen una subpoblación de linfocitos B, como se indica por los análisis de expresión de genes pax5 e IgM y la co-expresión del transgén mhc2dab::GFP. Además, se identificaron las células I ~ M a+is ladas a partir de riñón de la línea transgénica rag2::GFP (que marca las células progenitoras linfoides) lo que permitió discriminar subconjuntos discretos de diferentes estados de desarrollo de las células B (estadios del linaje B inmaduros y maduros). Además, se observó, a través de citometría de flujo y microscopía fluorescente, que las células que fagocitan micropartículas de poliestireno o bacterias, no expresan IgM en su superficie y no pueden ser identificadas como linfocitos B como se ha reportado en trucha y salmón. Haber identificado y separado linfocitos B en pez cebra es un logro que contribuye a nuestra comprensión del sistema inmune adaptativo de este teleósteo y que nos permitirá en un futuro aplicar este conocimiento a otras especies de teleósteos, incluyendo aquellas de interés comercial.