Examinando por Autor "Paredes-Sabja, Daniel"
Mostrando 1 - 20 de 38
Resultados por página
Opciones de ordenación
Ítem A feed-forward loop between SroC and MgrR small RNAs modulates the expression of eptB and the susceptibility to polymyxin B in Salmonella Typhimurium(Microbiology Society, 2016-11) Acuña, Lillian G.; Barros, M. José; Peñaloza, Diego; Rodas, Paula I.; Paredes-Sabja, Daniel; Fuentes, Juan A.; Gil, Fernando; Calderón, Iván L.Base-pairing small RNAs (sRNAs) regulate gene expression commonly by direct interaction with cognate mRNAs. Nevertheless, recent studies have expanded this knowledge with the discovery of the RNA ‘sponges’ which are able to interact and repress the functions of classical base-pairing sRNAs. In this work, we present evidence indicating that the sponge RNA SroC from Salmonella enterica serovar Typhimurium base pairs with the MgrR sRNA, thereby antagonizing its regulatory effects on both gene expression and resistance to the antimicrobial peptide polymyxin B (PMB). By a predictive algorithm, we determined putative SroC–MgrR base-pairing regions flanking the interaction area between MgrR and its target mRNA, eptB, encoding a LPS-modifying enzyme. With a two-plasmid system and compensatory mutations, we confirmed that SroC directly interacts and down-regulates the levels of MgrR, thus relieving the MgrR-mediated repression of eptB mRNA. Since it was previously shown that an Escherichia coli strain carrying an mgrR deletion is more resistant to PMB, we assessed the significance of SroC in the susceptibility of S. Typhimurium to PMB. Whereas the sroC deletion increased the sensitivity to PMB, as compared to the wild-type, the resistance phenotypes between the DmgrR and DsroCDmgrR strains were comparable, evidencing that mgrR mutation is epistatic to the sroC mutation. Together, these results indicate that both SroC and MgrR sRNAs compose a coherent feed-forward loop controlling the eptB expression and hence the LPS modification in S. Typhimurium.Ítem Analysis of Vibrio vulnificus infection risk when consuming depurated raw oysters(International Association for Food Protection, 2015-06) Deng, Kai; Wu, Xulei; Fuentes, Claudio; Su, Yi-Cheng; Welti-Chanes, Jorge; Paredes-Sabja, Daniel; Torres J., AntonioA beta Poisson dose-response model for Vibrio vulnificus food poisoning cases leading to septicemia was used to evaluate the effect of depuration at 15°C on the estimated health risk associated with raw oyster consumption. Statistical variability sources included V. vulnificus level at harvest, time and temperature during harvest and transportation to processing plants, decimal reductions (SV) observed during experimental circulation depuration treatments, refrigerated storage time before consumption, oyster size, and number of oysters per consumption event. Although reaching nondetectable V. vulnificus levels ([removed]Ítem Caracterización de la biología molecular de la oligomerización de la proteína rica en cisteína CdeC del exosporium de Clostridioides difficil(Universidad Andrés Bello, 2020) Troncoso Cotal, Scarlett Llerdolina Teresa; Paredes-Sabja, Daniel; Romero Rodríguez, Alba; Facultad de Ciencias de la VidaClostridioides difficile es un bacilo Gram-positivo, anaerobio estricto, formador de endoesporas y productor de toxinas (TcdA y TcdB) que se ha establecido como una de las principales causas de diarrea nosocominal asociada a antibióticos. El exosporium es la capa más externa de las esporas de C. difficile, y juega un rol en la interacción entre la espora y las células epiteliales del intestino en el hospedero. Se ha identificado la proteína rica en cisteína CdeC como factor morfogénico del correcto ensamblaje del exosporium. Estudios han evidenciado que CdeC forma especies multiméricas al analizar extractos de esporas de C. difficile y proteína recombinante por western blot. Recientemente analizamos la expresión de CdeC en E. coli Shuffle T7 por TEM, donde observamos que esta proteína se agrega en cuerpos de inclusión. Un análisis in silico de la secuencia de CdeC reveló que tiene 5 motivos de secuencia repetida y que 3 de ellos son ricos en cisteína, lo que sugiere que podrían tener un rol en su oligomerización. En base a estos antecedentes caracterizamos la oligomerización de CdeC mediante una dinámica de expresión heteróloga de esta proteína en E. coli a 21 y 37ºC durante diferentes periodos de tiempo. El análisis de la formación de oligómeros de CdeC se realizó a partir de la fracción soluble e insoluble obtenida a cada tiempo de expresión por SDSPAGE y western blot. Este análisis evidenció que CdeC forma oligómeros de alto peso molecular en etapas tempranas durante la expresión heteróloga en E. coli a 21 y 37ºC, pero estas especies están presentes en la fracción insoluble. El análisis de la expresión heteróloga de CdeC en las cepas de E. coli BL21 (DE3) pRIL y Shuffle T7, que se caracterizan por tener diferentes ambientes redox citoplasmáticos, reveló que proteína puede formar oligómeros en ambos ambientes redox, pero que se encuentran presentas en la fracción insoluble. Al analizar la expresión heteróloga de CdeC en E. coli BL21 (DE3) pRIL y Shuffle T7 por TEM evidenció que esta proteína se agrega en cuerpos de inclusión en ambas cepas, pero en la cepa BL21 (DE3) pRIL la proteína CdeC se agrega en cuerpos de inclusión que se caracterizan por tener una estructura laminar. El tratamiento de los cuerpos de inclusión de CdeC con un agente reductor de puentes disulfuro (DTT) produce la liberación de esta proteína recombinante agregada. El análisis de la expresión heteróloga de las variantes truncadas de CdeC a 21 y 37ºC reveló que forman complejos de alto peso molecular. La expresión heteróloga de M1-D100, M1-N214 y P206- R405 analizada por TEM evidenció que se agregan en cuerpos de inclusión que carecen de la estructura laminar presente en los cuerpos de inclusión de CdeC. Los hallazgos obtenidos en este estudio determinan que momento durante la expresión heteróloga en E. coli se forman los oligómeros de CdeC y el efecto de un agente reductor (DTT) en los cuerpos de inclusión de esta proteína, pero aún desconocemos que región(nes) de la secuencia de CdeC estaría(n) involucrada(s) en su oligomerización.Ítem Caracterización de la formación y germinación de las esporas de Turicibacter sanguinis K031(Universidad Andrés Bello, 2020) García Yunge, José Joaquín; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias de la VidaEl estudio de la microbiota intestinal ha revelado en el último tiempo que un gran número de complicaciones en la salud humana se deben a desbalances en ésta. El balance entre los microrganismos presentes en la microbiota y el hospedero ha sido reconocido como un elemento esencial de los seres vivos, ya que cumple funciones que el hospedero no puede realizar, tales como: metabolismo de algunos nutrientes, síntesis de algunas vitaminas y modulación específica del sistema inmune. La microbiota intestinal se compone principalmente de bacterias, donde la mayor parte de estas son bacterias anaeróbicas. Aun cuando se ha visto que la microbiota intestinal es de gran importancia para los hospederos, mucho se desconoce de ésta, desde cómo es la interacción entre las bacterias intestinales hasta cómo estas transitan entre los distintos hospederos. Respecto a lo último una de las hipótesis más aceptadas es que las bacterias de la microbiota intestinal utilizan un mecanismo de supervivencia conocido como esporulación, donde éstas forman una estructura resistente a condiciones adversas (espora bacteriana), que les permiten sobrevivir al ambiente exterior del intestino permitiendo así la colonizando de nuevos hospederos. Estudios recientes han revelado que aproximadamente un 30% de las bacterias de la microbiota intestinal poseen genes relacionados con el mecanismo de esporulación y en algunos casos se han podido identificar mediante microscopía estructuras que se han sugerido como posibles esporas bacterianas. A pesar de estos resultados, se desconoce si es que el mecanismo de esporulación presentado por estas bacterias de la microbiota es similar al mecanismo conocido hoy en día o si este deriva de los cánones establecidos. Una de estas bacterias es Turicibacter sanguinis, la cual es una bacteria poco conocida donde se identificó una estructura tipo espora que no se encuentra caracterizada. Por lo que se levanta la pregunta: ¿Es realmente la estructura encontrada en T. sanguinis una espora bacteriana similar a las formadas mediante el proceso de esporulación canónico? Para responder a esta pregunta se obtuvo, a partir de una nueva cepa aislada (T. sanguinis K031), estas estructuras descritas y se caracterizó sus cualidades fenotípicas básicas, su estructura y cómo es el proceso de formación de estas presuntas esporas bacterianas presentes en T. sanguinis K031. Además, se evaluó si en contacto con los medios de cultivo YCFA, BHIS y 70:30, las estructuras tenían la capacidad de poder revertir su morfotipo a una célula vegetativa y cómo era su comportamiento de germinación dentro del proceso. Los resultados de este trabajo sugieren fuertemente que la estructura encontrada para T. sanguinis K031 si es una espora bacteriana similar a las ya caracterizadas con cualidades, tanto fisiológicas como estructurales, que se presentan en esporas bacterianas canónicas.Ítem Caracterización de la vía endocítica de esporas de Clostridium difficile en células epiteliales intestinales y su implicancia en infecciones recurrentes de Clostridium difficile en un modelo murino(Universidad Andrés Bello, 2016) Castro Córdova, Pablo Andrés; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaClostridium difficile es un patógeno Gram-positivo, anaerobio estricto y formador de esporas. Este patógeno es el responsable de la mayoría de muertes causadas por diarreas asociadas a antibióticos. Las infecciones por C. difficile (ICD) tienen una elevada tasa de recurrencia, que varía entre el 20% después del primer episodio, a un 40 y 60% después del segundo y tercero, respectivamente. Se ha demostrado que las esporas son el morfotipo de transmisión y persistencia en C. difficile para generar infecciones por C. difficile recurrentes (ICD-R). Sin embargo, poco es conocido sobre los mecanismos de persistencia de las esporas en el hospedero. En este sentido, datos no publicados de nuestro laboratorio demuestran que las esperos de C. difficile son capaces de entrar en células epiteliales intestinales (CEIs) en un proceso dependiente de la polimerización actina, el cual podría ser uno de los mecanismos de persistencia. El objetivo de esta tesis es identificar las vías de endocitosis involucradas en la entrada de las esporas de la cepa R20291 de C. difficile y evaluar si el uso de inhibidores de la endocitosis de esporas reducen los casos de ICD-R en un modelo murino. En este trabajo encontramos que; i) mediante análisis de micrografías electrónicas de transmisión, microscopía confocal de fluorescencia e inhibidores farmacológicos, las esporas de C. difficile se asocian y requiren vesículas de clatrina, caveolina y macropinosomas para ingresar a las células; ii) el uso de un inhibidor de endocitosis en ratones infectados por C. difficile, redujo la incidencia de diarrea durante la ICD-R en un 67% y un 80% al ser administrados de forma intraperitoneal y oral respectivamente, lo cual sugiere que la endocitosis de esporas es el mecanismo de persistencia de C. difficile en el hospedero para generar ICD-R. En consecuencia, este trabajo amplía las aristas para generar terapias farmacológicas combinadas para tratar infecciones recurrentes por C. difficile.Ítem Caracterización del rol de C3 y C1q en la internalización de esporas de Clostridium difficile en células de epitelio intestinal(Universidad Andrés Bello, 2019) Brito Silva, Christian Andrés; Paredes-Sabja, DanielClostridium difficile es una bacteria Gram-positiva, patógena intestinal, causante de episodios recurrentes de diarrea, disrupción de la barrera epitelial y formación de pseudo membrana. El sistema del complemento actúa como barrera temprana del sistema inmune que modula tanto inmunidad innata como adaptativa. La relación de C. difficile con el complemento no ha sido estudiada, pero se ha reportado quela expresión de C3en el intestino se incrementa hasta 6 veces en respuesta a las toxinas de C. difficile sugiriendo un potencial rol en la patogénesis. Esta tesis se focalizó en estudiar la espora de C. difficiley el sistema del complemento ya que ha sido previamente reportado que BclA una proteína ortóloga encontrada en esporas de Bacillus anthracis captura moléculas del complemento para promover internalización en células del hospedero. En este estudio se encontró queC3y C1qse unena las esporas de C. difficile y además las esporas de la cepa R20291 activan C3 lo que promueve su unión a las esporas in vitro. La proteína tipo colágeno BclA3 participa en la unión de C3 y C1q a las esporas de la cepa hiper virulenta R20291 in vitro. En la cepa 630∆ermBclA1, BclA2 y BclA3 participan de la unión de C1q a las esporas in vitro. Ensayos de infección realizados con esporas incubadas en sueros de pletados de C1q y C3 mostraron que la internalización de esporas en células epiteliales intestinales Caco-2 disminuye respecto a la condición con suero humano normal (SHN). Al reconstituir estas moléculas la internalización de las esporas se restableció a niveles similares a la condición con SHN sugiriendo un posible mecanismo de internalización de esporas de C. difficile mediado por las moléculas delcomplementoC1q y C3que deberá ser explorado más en profundidad en futuros estudios.Ítem Characterization of germinants and their receptors for spores of non-food-borne Clostridium perfringens strain F4969(Microbiology Society, 2016-11) Banawas, Saeed; Paredes-Sabja, Daniel; Setlow, Peter; Sarker, Mahfuzur R.Clostridium perfringens type A can cause both food poisoning (FP) and non-food-borne (NFB) gastrointestinal diseases. Our previous study reported that a mixture of l-asparagine and KCl (AK)-germinated spores of FP and NFB isolates well, but KCl and, to a lesser extent, l-asparagine induced spore germination only in FP isolates. We now report that the germination response of FP and NFB spores differsignificantly in several defined germinants and rich media. Spores of NFB strain F4969 gerAA, gerKA-KC or gerKC mutants lacking specific germinant receptor proteins germinated more slowly than wild-type spores with rich media, did not germinate with AK and germinated poorly compared to wild-type spores with l-cysteine. The germination defects in the gerKA-KC spores were largely due to loss of GerKC as (i) gerKA spores germinated significantly with all tested germinants, while gerKC spores exhibited poor or no germination; and (ii) germination defects in gerKC spores were largely restored by expressing the wild-type gerKA-KC operon in trans. We also found that gerKA-KC, gerAA and gerKC spores, but not gerKA spores, released dipicolinic acid at a slower rate than wild-type spores with AK. The colony-forming efficiency of F4969 gerKC spores was also ~35-fold lower than that of wild-type spores, while gerAA and wild-type spores had similar viability. Collectively, these results suggest that the GerAA and GerKC proteins play roles in normal germination of C. perfringens NFB isolates and that GerKC, but not GerAA, is important in these spores' apparent viability.Ítem Characterization of ruminococcus sp.spore-like structures(Universidad Andrés Bello, 2020) Plaza Garrido, Angela Valeria; Paredes-Sabja, DanielThe intestinal microbiota community has a wide diversity of commensal bacteria, whose 50-60% of the bacterial genus contain spore-forming species. Ruminococcus spp., is one of the most abundant species in the human gut-microbiota. It makes to Ruminococcuscrucial for the degradation and fermentation of polysaccharides like cellobiose and starch. Currently, most of Ruminococcusstudies have focus on thesedegradation processes; however, still exist a deep unknowing on this bacteria’s transmission mechanism on humans. Despite that the literature reveals that Ruminococcuscan develop spores, the sporulation process and its properties have not been characterized yet; therefore, this research address the Ruminococcussp.DSM 102803 sporulation process, analyzing its sporulation-dynamic, morphotypes, stability, spores’ germination and ultra-structure protein composition.Results showed a late initiation of Ruminococcusspores compared to Bacillusand Clostridium with presence of four different Ruminococcusmorphotypes during the process: i) phase-dark structure (vegetative cells), ii) division cell, iii) phase-gray structure (intermediary), and iv) phase-bright structure (spore). According to TEM observations, phase-bright structure presents an ultra-structure different than canonical spores; however, it was not possible to see the exosporium, coat, and cortex. Additionally, results indicated that phase-bright structures are structurally stable to lysozyme, ethanol, and heat. At the same time, results reveled that phase-bright structure R.sp.DSM 102803 only are able of initiates germination in presences of sodium taurocholate, some amino acids, and salts; however, these componentsare not sufficient to carry out the process in a canonical way as in other spore-forming species. Finally, the protein analysis concluded that only Spo0J, McsA, Jag, dapG, SpoVS, SpoVK, SpoVAD, SpoVD, and alr2 proteins are specific to one sporulation stage, while no proteins participate on the germination process. These results conclude that the bright phase structures formed by R.sp.DSM 102803 are similar to spores of other spore-forming species. However, the sporulation and germination process must be characterized in greater depth in order to understand the genes and different processes that are involved in germination and sporulation.Ítem Characterization of the Adherence of Clostridium difficile Spores: The Integrity of the Outermost Layer Affects Adherence Properties of Spores of the Epidemic Strain R20291 to Components of the Intestinal Mucosa(FRONTIERS MEDIA SA, 2016-09) Mora-Uribe, Paola; Miranda-Cárdenas, Camila; Castro-Córdova, Pablo; Gil, Fernando; Calderón, Iván; Fuentes, Juan A.; Rodas, Paula I.; Banawas, Saeed; Sarker, Mahfuzur R.; Paredes-Sabja, DanielClostridium difficile is the causative agent of the most frequently reported nosocomial diarrhea worldwide. The high incidence of recurrent infection is the main clinical challenge of C. difficile infections (CBI). Formation of C. difficile spores of the epidemic strain R20291 has been shown to be essential for recurrent infection and transmission of the disease in a mouse model. However, the underlying mechanisms of how these spores persist in the colonic environment remains unclear. In this work, we characterized the adherence properties of epidemic R20291 spores to components of the intestinal mucosa, and we assessed the role of the exosporium integrity in the adherence properties by using cdeC mutant spores with a defective exosporium layer. Our results showed that spores and vegetative cells of the epidemic R20291 strain adhered at high levels to monolayers of Caco-2 cells and mucin. Transmission electron micrographs of Caco-2 cells demonstrated that the hair-like projections on the surface of R20291 spores are in close proximity with the plasma membrane and microvilli of undifferentiated and differentiated monolayers of Caco-2 cells. Competitive-binding assay in differentiated Caco-2 cells suggests that spore-adherence is mediated by specific binding sites. By using spores of a cdeC mutant we demonstrated that the integrity of the exosporium layer determines the affinity of adherence of C. difficile spores to Caco-2 cells and mucin. Binding of fibronectin and vitronectin to the spore surface was concentration-dependent, and depending on the concentration, spore-adherence to Caco-2 cells was enhanced. In the presence of an aberrantly-assembled exosporium (cdeC spores), binding of fibronectin, but not vitronectin, was increased. Notably, independent of the exosporium integrity, only a fraction of the spores had fibronectin and vitronectin molecules binding to their surface. Collectively, these results demonstrate that the integrity of the exosporium layer of strain R20291 contributes to selective spore adherence to components of the intestinal mucosa.Ítem Clostridium difficile toxins induce VEGF-A and vascular permeability to promote disease pathogenesis(Nature Publishing Group, 2019-02-01) Huang, Jun; Kelly, Ciarán P.; Bakirtzi, Kyriaki; Villafuerte Gálvez, Javier A.; Lyras, Dena; Mileto, Steven J.; Larcombe, Sarah; Xu, Hua; Yang, Xiaotong; Shields, Kelsey S.; Zhu, Weishu; Zhang, Yi; Goldsmith, Jeffrey D.; Patel, Ishan J.; Hansen, Joshua; Huang, Meijin; Yla-Herttuala, Seppo; Moss, Alan C.; Paredes-Sabja, Daniel; Pothoulakis, Charalabos; Shah, Yatrik M.; Wang, Jianping; Chen, XinhuaClostridium difficile infection (CDI) is mediated by two major exotoxins, toxin A (TcdA) and toxin B (TcdB), that damage the colonic epithelial barrier and induce inflammatory responses. The function of the colonic vascular barrier during CDI has been relatively understudied. Here we report increased colonic vascular permeability in CDI mice and elevated vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), which was induced in vivo by infection with TcdA- and/or TcdB-producing C. difficile strains but not with a TcdA − TcdB − isogenic mutant. TcdA or TcdB also induced the expression of VEGF-A in human colonic mucosal biopsies. Hypoxia-inducible factor signalling appeared to mediate toxin-induced VEGF production in colonocytes, which can further stimulate human intestinal microvascular endothelial cells. Both neutralization of VEGF-A and inhibition of its signalling pathway attenuated CDI in vivo. Compared to healthy controls, CDI patients had significantly higher serum VEGF-A that subsequently decreased after treatment. Our findings indicate critical roles for toxin-induced VEGF-A and colonic vascular permeability in CDI pathogenesis and may also point to the pathophysiological significance of the gut vascular barrier in response to virulence factors of enteric pathogens. As an alternative to pathogen-targeted therapy, this study may enable new host-directed therapeutic approaches for severe, refractory CDI.Ítem Clostridium perfringens sporulation and sporulation-associated toxin production(American Society for Microbiology, 2016) Li, Jihong; Paredes-Sabja, Daniel; Sarker, Mahfuzur R.; Mcclane, Bruce A.The ability of Clostridium perfringens to form spores plays a key role during the transmission of this Gram-positive bacterium to cause disease. Of particular note, the spores produced by food poisoning strains are often exceptionally resistant to food environment stresses such as heat, cold, and preservatives, which likely facilitates their survival in temperature-abused foods. The exceptional resistance properties of spores made by most type A food poisoning strains and some type C foodborne disease strains involve their production of a variant small acid-soluble protein-4 that binds more tightly to spore DNA than to the small acid-soluble protein-4 made by most other C. perfringens strains. Sporulation and germination by C. perfringens and Bacillus spp. share both similarities and differences. Finally, sporulation is essential for production of C. perfringens enterotoxin, which is responsible for the symptoms of C. perfringens type A food poisoning, the second most common bacterial foodborne disease in the United States. During this foodborne disease, C. perfringens is ingested with food and then, by using sporulation-specific alternate sigma factors, this bacterium sporulates and produces the enterotoxin in the intestines.Ítem Comprehensive genome analyses of sellimonas intestinalis, a potential biomarker of homeostasis gut recovery(Microbiology Society, 2020) Muñoz, Marina; Guerrero-Araya, Enzo; Cortés-Tapia, Catalina; Plaza-Garrido, Angela; Lawley, Trevor D.; Paredes-Sabja, DanielSellimonas intestinalis is a Gram-positive and anaerobic bacterial species previously considered as uncultivable. Although little is known about this Lachnospiraceae family member, its increased abundance has been reported in patients who have recovered from intestinal homeostasis after dysbiosis events. In this context, the aim of the present study was to take advantage of a massive in vitro culture protocol that allowed the recovery of extremely oxygen-sensitive species from faecal samples, which led to isolation of S. intestinalis. Whole genome analyses of 11 S. intestinalis genomes revealed that this species has a highly conserved genome with 99.7% 16S rRNA gene sequence similarity, average nucleotide polymorphism results >95, and 50.1% of its coding potential being part of the core genome. Despite this, the variable portion of its genome was informative enough to reveal the existence of three lineages (lineage-I including isolates from Chile and France, lineage-II from South Korea and Finland, and lineage-III from China and one isolate from the USA) and evidence of some recombination signals. The identification of a cluster of orthologous groups revealed a high number of genes involved in metabolism, including amino acid and carbohydrate transport as well as energy production and conversion, which matches with the metabolic profile previously reported for microbiota from healthy individuals. Additionally, virulence factors and antimicrobial resistance genes were found (mainly in lineage-III), which could favour their survival during antibiotic-induced dysbiosis. These findings provide the basis of knowledge about the potential of S. intestinalis as a bioindicator of intestinal homeostasis recovery and contribute to advancing the characterization of gut microbiota members with beneficial potential. © 2020, Microbiology Society. All rights reserved.Ítem Descripción de resultados obtenidos de análisis morfológico del exosporium en la espora de la cepa clostridioides difficile gayatri(Universidad Andrés Bello, 2020) Montecinos Rojas, Francisco Javier; Paredes-Sabja, Daniel; Romero Rodríguez, Alba; Facultad de Ciencias de la VidaClostridioides difficile es una bacteria anaerobia estricta, Gram positivo, formadora de esporas. Es la principal causa de infecciones asociadas al uso de antibióticos en la atención médica en todo el mundo, la bacteria fue descrita por primera vez en 1935 como parte de la microbiota de los neonatos, pero no fue hasta 1978 cuando se reportaron los primeros casos de infección atribuidos a esta bacteria, la cual se denomina infección de Clostridium difficile, o CDI por sus siglas en inglés. Esta bacteria produce 2 toxinas principales, la toxina A o TcdA y la toxina B o TcdB respectivamente. Estas toxinas son las responsables de la sintomatología de la infección en donde se observan episodios de diarrea, megacolon tóxico, colitis pseudomembranosa e incluso llegando hasta la muerte. Dado sus requerimientos estrictamente anaerobios, su mecanismo de transmisión es la espora, la cual es producida naturalmente por la bacteria. La espora, además, es la responsable de los casos de reincidencia en la infección. En estudios anteriores, se ha observado que, en una de las capas de la espora, específicamente el exosporium, existen variadas proteínas, dentro de ellas se encuentra la proteína CdeC, a la cual se le han atribuido roles morfogénicos para el exosporium y un rol en la distribución de los morfotipos del exosporium grueso y delgado. En este proyecto de tesis se estudio la morfología del exosporium de la espora, en el cual se han observado 2 morfotipos bastante diferenciados, un exosporium grueso y un exosporium delgado. Este proceso se realizó con imágenes de las esporas captadas con Microscopia de transmisión electrónica, luego fueron analizadas por el programa ImageJ y se logró separar entre poblaciones con exosporium delgado y grueso, para analizar la distribución de estos morfotipos en las poblaciones de las esporas. Adicionalmente, se midió de forma cuantitativa el grosor del exosporium, tanto para las poblaciones de exosporium delgado y grueso. Por otra parte, se realizaron mediciones de ácido dipicolínico y un ensayo de tinción de las esporas con Hoechst. Estos ensayos se realizaron en una cepa aislada, proveniente de un ambiente hospitalario, la cual se denominó Clostridioides difficile Gayatri y con la cepa de Clostridioides difficile 630erm, usada comúnmente como cepa modelo para los ensayos realizados en laboratorio, con esto se buscó realizar una comparación con resultados anteriores obtenidos en la cepa epidemiológica R20291.Ítem Efecto de la ausencia de las proteínas de la cubierta CotA, CotB y CotCB en la abundancia y distribución de la proteína del exosporium de Clostridiodes difficile, CdeA(Universidad Andrés Bello, 2020) Medina Núñez, César Andrés; Paredes-Sabja, Daniel; Romero Rodríguez, Alba; Facultad de Ciencias de la VidaClostridium difficile es una bacteria patógena que se ha convertido en la principal causa de diarreas nosocomiales en los últimos años. Es capaz de generar un cuadro infeccioso (CDI) y es capaz de formar esporas, las cuales utiliza como vehículo de infección para llegar a su objetivo en el tracto gastrointestinal. La espora es una estructura extremadamente resistente a las condiciones ambientales adversas e importante para el ciclo infectivo de C. difficile, se sabe que sin la espora C. difficile sería incapaz de realizar una correcta colonización ya que no podría sobrevivir fuera del ambiente colónico en su forma vegetativa. Se conoce que su resistencia medioambiental depende principalmente de las capas proteicas conocidas como cubierta y exosporium CdeA es una proteína rica en cisteína parte del exosporium de la espora de Clostridium difficile, se han descritos ortólogos presentes en bacterias del tracto intestinal. Las proteínas ricas en cisteína se han caracterizado por cumplir un rol importante en la estructura de la espora, pudiendo afectar el reclutamiento de otras proteínas o la distribución de estas en la superficie de la espora. Para profundizar en el papel de esta proteína en la espora de C. difficile, es que en este trabajo se observa cómo se comporta ante la ausencia de proteínas de la cubierta de la espora, como son las proteínas CotA, CotB y CotCB. Por lo que se hará uso de esporas mutantes junto a un plásmido con la fusión CdeA-FLAG, lo que nos permite observar el efecto de la ausencia de estas proteínas en la abundancia, distribución y accesibilidad de CdeA. Los datos recopilados en este trabajo nos permiten concluir que las proteínas de la cubierta CotA, CotB y CotCB son necesarias para tener niveles de abundancia normales de CdeA en la espora de C. difficile, siendo que CotA y CotCB produzcan una disminución en la abundancia de CdeA, mientras que CotB produce un aumento.Ítem Effect of microalgae on intestinal inflammation triggered by soybean meal and bacterial infection in zebrafish(PLoS ONE, 2017-11) Bravo-Tello, Karina; Ehrenfeld, Nicole; Solís, Camila J.; Ulloa, Pilar E.; Hedrera, Manuel; Pizarro-Guajardo, Marjorie; Paredes-Sabja, Daniel; Feijóo, Carmen G.Soybean meal has been used in many commercial diets for farm fish; despite this component inducing intestinal inflammation. On the other hand, microalgae have increasingly been used as dietary supplements in fish feed. Nevertheless, the vast quantity of microalgae species means that many remain under- or unstudied, thus limiting wide scale commercial application. In this work, we evaluated the effects to zebrafish (Danio rerio) of including Tetraselmis sp (Ts); Phaeodactylum tricornutum (Pt); Chlorella sp (Ch); Nannochloropsis oculata (No); or Nannochloropsis gaditana (Ng) as additives in a soybean meal-based diet on intestinal inflammation and survival after Edwardsiella tarda infection. In larvae fed a soybean meal diet supplemented with Ts, Pt, Ch, or Ng, the quantity of neutrophils present in the intestine drastically decreased as compared to larvae fed only the soybean meal diet. Likewise, Ts or Ch supplements in soybean meal or fishmeal increased zebrafish survival by more than 20% after being challenged. In the case of Ts, the observed effect correlated with an increased number of neutrophils present at the infection site. These results suggest that the inclusion of Ts or Ch in fish diets could allow the use of SBM and at the same time improve performance against pathogen. © 2017 Bravo-Tello et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.Ítem Esporas de Clostridium difficile y su relevancia en la persistencia y transmisión de la infección(Sociedad Chilena de Infectología, 2014-12) Barra-Carrasco, Jonathan; Hernández-Rocha, Cristian; Ibáñez, Patricio; Guzmán-Durán, Ana M.; Álvarez-Lobos, Manuel; Paredes-Sabja, DanielClostridium difficile es un patógeno anaerobio, formador de esporas y el agente etiológico más importante de las diarreas asociadas a antimicrobianos, tanto nosocomiales como adquiridas en la comunidad. Las infecciones asociadas a C. difficile poseen una elevada tasa de morbilidad en países desarrollados y en vías de desarrollo. Los dos factores de virulencia principales son TcdA y TcdB, toxinas que causan la remodelación del citoesqueleto lo cual desencadena los síntomas clínicos asociados a esta enfermedad infecciosa. A pesar que las esporas de C. difficile son el principal vehículo de infección, persistencia en el hospedero y de transmisión, pocos estudios se han enfocado sobre este clave aspecto. Es altamente probable que la espora juegue roles esenciales en los episodios de recurrencia y de transmisión horizontal de la infección por este microorganismo. Estudios recientes han revelado características únicas de las esporas de C. difficile que las hacen capaces de ser altamente transmisibles y persistir dentro del hospedero. Más aún, algunas de estas propiedades están relacionadas con la resistencia de sus esporas a los desinfectantes más comúnmente usados en los recintos hospitalarios. La presente revisión resume los conocimientos más relevantes en la biología de las esporas de C. difficile, con un énfasis en aquellos aspectos con implicancias clínicas, incluido el control de infecciones en el ambiente hospitalario.Ítem Evaluación de la correlación entre un polimorfismo en GPBAR1 y la gravedad clínica de la infección por clostridium difficile(Universidad Andrés Bello, 2017) Galilea Solar, Constanza Paola.; Hernández, Cristian; Paredes-Sabja, Daniel; Facultad de Ciencias Biológicas; Escuela de Ingeniería en BiotecnologíaClostridium difficile, el principal responsable de las diarreas causadas por el uso de antibióticos ligadas a la atención en salud, posee manifestaciones clínicas muy diversas, lo que hace necesario identificar factores que determinen un mayor riesgo de desarrollar una infección por C. difficile (ICD) grave. En estudios en ratones, el receptor de ácidos biliares GPBAR1 ha sido asociado a alteraciones en la estructura epitelial del colon y a un aumento en la gravedad de la colitis química. En humanos, se ha observado una relación entre el polimorfismo de nucleótido simple (SNP), rs11554825 del gen GPBAR1 y algunas enfermedades gastrointestinales. En esta tesis se evaluó si la presencia de esta variante en pacientes se correlaciona con un aumento en la gravedad de la ICD. Se genotipificaron 67 pacientes con ICD y se relacionó la presencia del polimorfismo con parámetros clínicos los cuales indican la gravedad de la infección. También se determinó si existe relación entre el SNP y la respuesta inmune mediante la cuantificación del ARNm de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1β, IL-8, IFN-γ y TNF-α, los títulos de IgG anti-toxina A y B en plasma y los niveles de calprotectina fecal como marcador de la inflamación intestinal. En los parámetros clínicos se vio un aumento del volumen de diarrea, así como de una disminución en la presión arterial sistólica en los portadores del SNP. Respecto a los parámetros de laboratorio, no se observaron diferencias significativas, pero si una tendencia a un mayor número de leucocitos y a un mayor nivel de proteína C reactiva. No lograron detectarse diferencias entre los pacientes con distintos alelos para el nivel de citoquinas, pero si se encontró un aumento en el nivel de IgG antitoxina A, y un mayor nivel de calprotectina fecal en los pacientes con el SNP. Estos resultados sugieren que existe una mayor gravedad en el cuadro clínico y una mayor inflamación en pacientes que presentan el SNP en relación a los pacientes sin el SNP. El aporte de este trabajo consistió en determinar un nuevo factor genético asociado a ICD grave, el cual pudiese ayudar a seleccionar pacientes con peor pronóstico y determinar un potencial nuevo blanco terapéutico en ICD.Ítem Genome sequence of clostridium paraputrificum 373-A1 isolated in Chile from a patient infected with Clostridium difficile(American Society for Microbiology, 2016) Guerrero-Araya, Enzo; Plaza-Garrido, Angela; Díaz-Yañez, Fernando; Pizaro-Guajardo, Marjorie; Valenzuela, Sandro L.; Meneses, Claudio; Gil, Fernando; Castro-Nallar, Eduardo; Paredes-Sabja, DanielClostridium paraputrificum is a gut microbiota member reported in several cases of bacteremia and coinfections. So far, only one genome sequence of a C. paraputrificum (AGR2156) isolate is available. Here, we present the draft genome of C. paraputrificum strain 373-A1, isolated from stools from a patient with C. difficile infection.Ítem Identification of Clostridium difficile Immunoreactive Spore Proteins of the Epidemic Strain R20291(Wiley-VCH Verlag, 2018-09) Pizarro-Guajardo, Marjorie; Ravanal, María Cristina; Paez, Maria Daniela; Callegari, Eduardo; Paredes-Sabja, DanielPurpose: Clostridium difficile infections are the leading cause of diarrhea associated with the use of antibiotics. During infection, C. difficile initiates a sporulation cycle leading to the persistence of C. difficile spores in the host and disease dissemination. The development of vaccine and passive immunization therapies against C. difficile has focused on toxins A and B. In this study, an immunoproteome-based approach to identify immunogenic proteins located on the outer layers of C. difficile spores as potential candidates for the development of immunotherapy and/or diagnostic methods against this devastating infection is used. Experimental design: To identify potential immunogenic proteins on the surface of C. difficile R20291, spore coat/exosporium extracts are separated by 2D electrophoresis (2-DE) and analyzed for reactivity against C. difficile spore-specific goat sera. Finally, the selected spots are in-gel digested with chymotrypsin, peptides generated are separated by nanoUPLC followed by MS/MS using Quad-TOF-MS, corroborated by Ultimate 3000RS-nano-UHPLC coupled to Q-Exactive-Plus-Orbitrap MS. Results: The analysis identify five immunoreactive proteins: spore coat proteins CotE, CotA, and CotCB; exosporium protein CdeC; and a cytosolic methyltransferase. Conclusion: This data provides a list of spore surface protein candidates as antigens for vaccine development against C. difficile infections. © 2018 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, WeinheimÍtem Induction of a Specific Humoral Immune Response by Nasal Delivery of Bcla2ctd of Clostridioides difficile(MDPI AG, 2020-02) Maia, Ana Raquel; Reyes-Ramírez, Rodrigo; Pizarro-Guajardo, Marjorie; Saggese, Anella; Castro-Córdova, Pablo; Isticato, Rachele; Ricca, Ezio; Paredes-Sabja, Daniel; Baccigalupi, LoredanaClostridioides difficile, formerly known as Clostridium difficile, is a spore-forming bacterium considered as the most common cause of nosocomial infections in developed countries. The spore of C. difficile is involved in the transmission of the pathogen and in its first interaction with the host; therefore, a therapeutic approach able to control C. difficile spores would improve the clearance of the infection. The C-terminal (CTD) end of BclA2, a spore surface protein of C. difficile responsible of the interaction with the host intestinal cells, was selected as a putative mucosal antigen. The BclA2 fragment, BclA2CTD, was purified and used to nasally immunize mice both as a free protein and after adsorption to the spore of Bacillus subtilis, a well-established mucosal delivery vehicle. While the adsorption to spores increased the in vitro stability of BclA2CTD, in vivo both free and spore-adsorbed BclA2CTD were able to induce a similar, specific humoral immune response in a murine model. Although in the experimental conditions utilized the immune response was not protective, the induction of specific IgG indicates that free or spore-bound BclA2CTD could act as a putative mucosal antigen targeting C. difficile spores. © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland.