Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado

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Examinando Fac.CV - Trabajos de Titulación Post-Grado por Autor "Acuña Olivares, Lilian"

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    Detección de la expresión de RNAs no codificantes de Salmonella Typhimurium en líneas celulares, utilizando como herramienta el sistema CRISPR/Cas13a
    (Universidad Andrés Bello, 2021) Montt Cartes, Fernanda; Calderón, Iván; Acuña Olivares, Lilian; Facultad de Ciencias de la Vida
    S. Typhimurium es una bacteria Gram negativo capaz de generar enfermedades gastrointestinales en humanos. Este patógeno es capaz de infectar diferentes tipos celulares dentro de los cuales sobrevive regulando la expresión génica, lo cual puede ser utilizando RNAs pequeños no codificantes (sRNAs) que actúan mediante apareamiento con mRNAs blancos. Existen diversos sRNAs que podrían estar relacionados con procesos de virulencia como invasión, proliferación o la capacidad de Salmonella de persistir en células como macrófagos, fibroblastos, células epiteliales y/o células dendríticas. Para analizar la participación de estos sRNAs en distintas etapas de infección y tipos celulares que Salmonella enfrenta, estostranscritos deben ser detectados. Para esto existen estrategias experimentales que nos permiten detectar estas moléculas, pero muchas de éstas requieren varios pasos sucesivos y diversos equipos, implicando así gran manipulación de las muestras, lo que en el caso de un sRNA es particularmente importante ya que son moléculas muy lábiles y propensas a degradación. Por otro lado, en ciertas células existe una baja población bacteriana, producto de la propia adaptación del patógeno a dicho ambiente, dificultando en cierta medida la detección de sRNAs, producto del poco material de partida. Estas condiciones nos llevan a proponer una herramienta molecular de detección basada en el sistema de defensa bacteriano CRISPR/Cas13a, que detecte de forma simple y específica un determinado sRNA mediante apareamiento de bases con un CRISPR RNA (crRNA) complementario. Para el CRISPR/Cas13a, se sabe que el apareamiento de un crRNA con su RNA blanco específico, acciona la actividad RNAsa colateral de Cas13. Esta propiedad puede ser aprovechada biotecnológicamente para un sistema de detección de un transcrito específico, ya que Cas13a puede degradar inespecíficamente RNAsreporteros presentes en el medio, modificados con un sistema quencher-fluorósforo, provocando así una emisión de florescencia. En el presente trabajo se hipotetiza que es posible detectar de forma específica un sRNA de S. Typhimurium desde bacterias intracelulares con este sistema CRISPR/Cas13a. Utilizando como modelo el sRNA IsrG (pre-identificado como marcador de infección) y líneas celulares como macrófagos, células epiteliales y fibroblastos, se generó un sistema de detección in vitro basado en la proteína Cas13 y un crRNA específico para el sRNA IsrG. La emisión de fluorescencia observada en nuestro ensayo, además de evidenciar la detección específica del sRNA IsrG y con una sensibilidad del orden de los 3 µg, permitió validar la técnica para detectar transcritos desde bacterias intracelulares.
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    Rol de la proteína chaperona Hfq en el mantenimiento de la homeostasis de la envoltura bajo estrés osmótico en el patógeno de salmónidos Yersinia ruckeri
    (Universidad Andrés Bello, 2023) Pedraza Delgado, Diego Antonio; Calderón, Iván; Acuña Olivares, Lilian; Facultad de Ciencias de la Vida
    Yersinia ruckeri es una bacteria Gram negativo capaz de transitar entre agua dulce y salada. Es un patógeno de salmones que genera brotes de infección en las salmoneras, afectando la producción de salmones a nivel mundial. En el contexto de la exposición a condiciones hiperosmóticas, es sabido que otras bacterias activan sistemas transcripcionales de respuesta a estrés de envoltura, como los sistemas RpoE y CpxAR. A su vez, estos sistemas mantienen la homeostasis de la envoltura bacteriana mediante la síntesis de RNAs pequeños no codificantes (sRNA) que se asocian a la proteína chaperona Hfq y a un mRNA blanco, reprimiendo o promoviendo su expresión para modular la arquitectura del lipopolisacárido (LPS) y de la envoltura celular en conjunto (membrana interna (MI), membrana externa (ME), peptidoglicano (PG)). A la fecha, se desconocen los mecanismos moleculares de respuesta al estrés salino en Y. ruckeri. Por tal razón, en esta Tesis nos propusimos estudiar el rol de Hfq en la respuesta a estrés de envoltura bajo estrés osmótico en Y. ruckeri. Para esto, se utilizó una cepa deficiente del gen hfq (Δhfq) de Y. ruckeri que fue tratada con distintas concentraciones de NaCl para generar la condición de estrés osmótico y realizar análisis fenotípicos como curvas de crecimiento, ensayos de UFC, perfil de proteínas de membrana externa y LPS y microscopías electrónicas (TEM). Por otro lado, se realizaron análisis para evaluar si el estrés generado por el tratamiento con NaCl genera daño en la membrana, lo cual fue evaluado por análisis de citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, demostrándose que la cepa Δhfq presenta un fenotipo más resistente a altas concentraciones de NaCl, en comparación con la cepa silvestre (WT). Además, se analizó diferencias en los perfiles de proteínas de membrana externa y la composición del LPS, mediante SDS-PAGE, evidenciándose una desregulación respecto al perfil de la cepa WT. Finalmente, se analizó la expresión génica de reguladores mediante RT-qPCR y se observó que la condición de NaCl usada genera estrés por envoltura, aumentando la expresión de genes como rpoE, cpxR, degP y de sRNAs como MicA y CpxQ. Por otro lado, en la cepa Δhfq los niveles de los sRNAs MicA y CpxQ disminuyen significativamente respecto a lo observado en la cepa WT tratada con NaCl. Asimismo, en la cepa Δhfq se observa una desregulación en la expresión de los genes relacionados con la homeostasis de la envoltura bacteriana; ompA/F/C, skp, lpp, rpoE y cpx. En su conjunto, estos resultados indican que la cepa Δhfq presenta diversos fenotipos alterados relacionados con la homeostasis de envoltura, así como también con la resistencia al estrés osmótico, sugiriendo un rol regulatorio de Hfq en la respuesta global a estrés por envoltura gatillado por NaCl.